Luso dellOstracodtoxkit per la valutazione della tossicit dei

L’uso dell’Ostracodtoxkit per la valutazione della tossicità dei sedimenti

I saggi di tossicità Øsono procedure che prevedono l’esposizione di alcune specie indicatrici a campioni ambientali in condizioni sperimentali controllate.

I saggi di tossicità su singola specie Øcostituiscono i metodi che oggi realisticamente possono essere impiegati nel monitoraggio

I saggi di tossicità su singola specie Øconsentono di rilevare potenziale problemi in un comparto ambientale e di quantificare mediante misure ripetibili un pericolo tossico

Vantaggi Ø forniscono un misura diretta e quantificabile del rischio che si manifestino effetti dannosi per il biota Ø forniscono informazioni degli effetti sinergici e antagonisti che si possono manifestare tra sostanze diverse

Vantaggi Ø possiedono un maggiore potere risolutivo rispetto ad altri metodi bio-ecologici, in quanto basati su procedure controllate Ø sono metodi abbastanza veloci e generalmente poco dispendiosi

Limiti Ø la difficoltà di mettere in relazione i risultati ottenuti con esposizioni in laboratorio con la reale esposizione in un sito Ø la scarsa capacità predittiva di effetti reali per le popolazioni e le comunità

Stima della tossicità acuta cronica esposizione a breve termine esposizione a lungo termine <1/10 del ciclo vitale > 1/10 del ciclo vitale

Perché i sedimenti Ø agiscono come dell’inquinamento integratori nel tempo Ø rappresentano il principale deposito e la principale fonte di riserva di inquinanti Ø costituiscono l’habitat per numerosi organismi acquatici

Saggi sui sedimenti Ø si possono utilizzare su diverse matrici : sedimento tal quale sedimento risospeso acqua interstiziale estratti acquosi estratti organici Ø ognuna è riconducibile a un diverso tipo di esposizione

Utilizzo appropriato dei saggi campionamento integrità del campione rappresentatività del sito trattamento conservazione modificazione del campione

OSTRACODTOXKIT Ø e’ un test di tossicità a “diretto contatto” per i sedimenti di acqua dolce Ø utilizza il crostaceo ostracode Heterocypris incongruens come specietest

OSTRACODTOXKIT Ø e’ un microbiotest per la tossicità cronica dei sedimenti in toto caratteristiche Ø fornisce gli organismi allo stadio quiescente (cisti) Ø fornisce un sedimento di riferimento atossico

Heterocypris incongruens ecologia Ø vive in tutti gli ambienti di acqua dolce a contatto dei sedimenti Ø si nutre di alghe e batteri Ø e’ cosmopolita

Heterocypris incongruens sensibilità Ø comparabile all’anfipode Hyallela azteca Ø maggiore del chironomide Chironomus riparius

Endpoints del test valutati a 6 giorni : Ømortalità Øinibizione della crescita

Ostracodtoxkit Giorno 1 : schiusa delle cisti Ø acqua dolce ricostituita pre-ossigenata (15 minuti) Ø incubazione 52 h, 25° C ed illuminazione di 4000 lux

Ostracodtoxkit Giorno 3 : lunghezza iniziale degli ostracodi neonati Ø allo scadere delle 48 h si aggiunge l’alga Spirulina Ø si misura la lunghezza di 10 organismi mediante un vetrino graduato (scala di 50 mm) Ø lunghezza iniziale: 200 -250 mm

Ostracodtoxkit Giorno 3 : allestimento della piastra Ø 3 x 107 cellule dell’alga Raphidocelis subcapitata sono aggiunte a 10 organismi trasferiti in ogni pozzetto della piastra

Ostracodtoxkit Giorno 3 : aggiunta dei sedimenti Ø 4 o 6 repliche per controllo e sedimenti test Ø 300 ml di sedimenti sono aggiunti nei pozzetti Ø incubazione : 25°C, al buio, per 6 giorni

Ostracodtoxkit Giorno 9 : lettura del test Ø recupero degli ostracodi attraverso ripetuti lavaggi dei pozzetti Ø recupero degli ostracodi vivi Ø misura della lunghezza

Espressione dei dati mortalità inibizione crescita si esprime come valore medio percentuale IC (%) = Lc-Lx x 100 —— Lc Lc= incremento medio del controllo Lx = incremento medio del campione test sedimenti test : si sottrae la mortalità del controllo

Condizioni di validità del test Ø mortalità media < 10% ostracodi di controllo Ø incremento medio della lunghezza 400 mm

Un po’ di numeri… Lunghezza (mm) Iniziale (n=40) 238 Lunghezza (mm) Finale (n=100) 702 min 200 min 600 max 250 max 800 CV% 9 CV% 7, 8

Valutazione dell’impatto di acque reflue sullo stato ecologico del corpo idrico recettore fosso della Casaccia direttiva 2000/60/CE : 1. Caratterizzazione ecologica 2. Monitoraggio 3. Progetto fattibilità

Area di studio Ø 4 siti di prelievo Ø 4 campagne : controllo 0 (marzo 2002) scarico 1 (marzo 2002) controllo 1 (maggio 2002) scarico 2 (ottobre 2002)

Valutazione della tossicità dei sedimenti Ø determinare la distribuzione spaziotemporale della contaminazione biodisponibile Ø valutare l’efficacia del piano di risanamento

Saggi per la valutazione della tossicità dei sedimenti tossicità acuta tossicità cronica test della bioluminescenza con il batterio Vibrio fisheri test con l’ostracode Heterocypris incongruens

Fasi preliminari dei saggi di tossicità • con sessola prelievi • strato superficiale (5 -10 cm) • 4°C al buio conservazione • 2 settimane • setacciatura (1 mm) trattamento • centrifugazione • in toto (ostracodi) matrice • fase solida (batteri)

Heterocypris incongruens : mortalità

Mortalità-classi di qualità staz. controllo 0 scarico 1 controllo 1 mortalità (Dm) tossicità Dm < 20 assente 20 Dm < 40 bassa 2 13 27 42 3 18 28 35 40 Dm< 60 media 4 0 5 12 60 Dm <80 alta 5 1 5 25 Dm 80 elevata

Heterocypris incongruens : accrescimento

Accrescimento-classi di qualità siti controllo 0 scarico 1 controllo 1 accrescimento tossicità Da 120 biostimolazione 2 51 44 53 80 Da < 120 assente 3 68 75 52 60 Da < 80 bassa 40 Da < 60 media 20 Da < 40 alta Da < 20 elevata 4 71 81 61 5 70 70 88

Confronto mortalità/accrescimento siti controllo 0 Dm Da scarico 1 Dm Da controllo 1 Dm 2 assente media bassa 3 assente bassa 4 assente bassa assente bassa 5 assente bassa assente endpoint media Da bassa media che individua la classe peggiore di tossicità

Relazione mortalità/accrescimento Øla valutazione di un effetto subletale (accrescimento) aumenta la sensibilità e la capacità discriminante del test in particolare quando i sedimenti non inducono sugli ostracodi effetti acuti (mortalità)

Tossicità acuta con Vibrio fisheri Unità Tossicità : 100/EC 50

Vibrio fisheri-classi di qualità siti controllo 0 scarico 1 controllo 1 2 10 12 9 3 83 20 23 4 5 4 6 5 11 7 8 Unità Tossicità tossicità < 10 assente 10 -100 bassa 100 -1000 media 1000 -10000 alta > 10000 elevata

Tossicità complessiva dei sedimenti siti controllo 0 scarico 1 controllo 1 2 media 3 media bassa media 4 bassa assente bassa 5 bassa H. incongruens V. fisheri tutti e due

Considerazioni sul monitoraggio Ø i sedimenti del fosso della Casaccia inducono effetti di tossicità sia acuta che cronica già dalla campagna di prelievo “controllo 0” Ø pertanto sarà possibile esprimere una valutazione dell’ impatto degli scarichi solamente in seguito a ripetute campagne di monitoraggio

Considerazioni sull’ostracodtoxkit Ø la buona standardizzazione e la facilità di esecuzione lo rendono un test certamente utile nella valutazione della tossicità di sedimenti di acqua dolce Ø i dati di tossicità riportati hanno evidenziato una elevata sensibilità dell’ostracode Heterocypris incongruens

Considerazioni sull’ostracodtoxkit Ø sarebbe opportuno allestire un controllo positivo per “tarare” la risposta di H. incongruens ad una sostanza tossica di riferimento Ø effettuare una lettura dell’endpoint “mortalità” dopo 24 ore di incubazione per approfondirne l’interpretazione