Luku 5 Geenitekniikan perusteet Koralli 5 Geenitekniikka on

Luku 5 Geenitekniikan perusteet Koralli 5

Geenitekniikka ● on biotekniikan osa-alue ● tutkii ja kehittää käyttösovelluksia soluista tai solun osista ● soveltaa molekyylibiologian tai biokemian tietotaitoja ● hyödyntää geenien kemiallista rakennetta ja yleismaailmallista geneettistä koodia sisältää aminohappoja vastaavat kolmen emäsparin jonot (kodonit) DNA- tai RNA-molekyylissä. ● soveltaa useita eri tutkimusmenetelmiä Koralli 5

DNA: n rakenne ja ominaisuudet • DNA: n ○ ○ ○ ominaisuudet perustuvat: emäsrakennetta koossa pitäviin vetysidoksiin heikkoihin vuorovaikutuksiin (kierrerakenne) sokeri-fosfaattirungon välisiin esterisidoksiin (perusrakenne) ○ fosforihapon osittaiseen protolysoitumiseen (nukleiinihappojen happamuus). Koralli 5

Koralli 5

DNA: n eristäminen ja puhdistus ● Tutkimista varten DNA eristetään solusta. ● DNA on solun tumassa ympäröivät rakenteet hajotetaan. ● Eristys tehdään kylmässä näytettä hajottavien entsyymien vaikutuksen minimointi. ● Eristämisessä hyödynnetään orgaanisia liuottimia ja uuttoa. Koralli 5

Koralli 5

Geenitekniikassa käytettyjä entsyymejä ● Geenitekniikka perustuu pääosin bakteereista eristettyjen entsyymien avulla tehtäviin reaktioihin. ● Yleisimmin käytettyjä entsyymejä: ○ restriktio- eli katkaisuentsyymit ○ ligaasi- eli liittäjäentsyymit ● Muita entsyymejä: ○ terminaalitransferaasi (juosteiden muokkaus) ○ DNA-polymeraasi ○ käänteiskopioijaentsyymi (kopioi RNA: n DNA: ksi) ○ DNA-polymeraasientsyymi (hyvä lämmönsietokyky) Koralli 5

Katkaisuentsyymit ● Katkaisuentsyymejä käytetään irrotettaessa siirrettäviä geenejä eliöiden perimästä bioleikkuri ● Katkaisuentsyymejä on erilaisia (tunnetaan >200) ● Kukin katkaisuentsyymi tunnistaa DNA-juosteesta tietyn nukleotidin emäsjärjestyksen (=restriktiokohta) ○ entsyymi katkaisee DNA-juosteen aina tietystä ja samasta kohdasta Koralli 5

Ligaasientsyymit Kaikissa soluissa Eristetään kolibakteereista Tehtävänä on ligaatio Käytetään liittämään DNA-pätkiä yhteen tai korjaamaan DNA-vaurioita ● DNA: n katkaisukohta on joko tunnistusjärjestyksen sisällä tai ulkopuolella ● Katkaisuentsyymien katkaisukohtaan muodostuvat joko: ● ● ○ koheesiiviset eli tahmeat päät: liittyvät toisiinsa komplementaarisesti ○ tylpät päät: DNA katkeaa molemmissa juosteissa samasta kohtaa eivät pysty tarttumaan toisiinsa kiinni komplementaarisesti Koralli 5

Terminaalitransferaasientsyymit ● Entsyymin avulla pystytään syntetisoimaan katkaistun (tylpän) kohdan jatkoksi DNA: n toiseen nauhaan ○ poly-A-häntä (pelkkää adeniinia eli AAAA. . . ) ○ Katkaisukohdan toiselle puolelle jää vastinnauhaan poly. T-häntä eli TTTT… ● Samoin voidaan lisätä poly-C-häntä tai poly-G-häntä ● Menetelmän avulla saadaan kohesiiviset eli toisiinsa tarttuvat päät voidaan liittää ligaasientsyymin avulla yhteen. Koralli 5

Geenikirjastot ● Useimmiten bakteeriviljelmään siirretty eliön perimä tai osa siitä. ● DNA: ta voidaan säilyttää myös hiivoissa ja viruksissa. ● Tarvittaessa geenikirjastosta voidaan hakea ja eristää tarvittavia geenejä. ● Geenikirjastoja on kahdenlaisia: ○ ○ genomisia geenikirjastoja vastin-DNA- eli c. DNA-kirjastoja. ● Genomiset geenikirjastot sisältävät mahdollisimman kattavan kokoelman eliön kromosomaalisesta DNA: sta ○ geenien ulkopuolisen ja intronien sisältämän DNA: n sekä geenien säätelyalueet ○ Koralli 5

Geenikirjaston rakentaminen ja geenin kloonaus • Sekä genomisen että vastin-DNA -kirjaston tekemistä varten tarvitaan puhdistettua DNA: ta • DNA hajotetaan katkaisuentsyymeillä sopiviksi pätkiksi • Vastin-DNA-kirjasto: • • lähetti-RNA käännetään käänteiskopioijaentsyymin avulla vastin-DNA: ksi liitetään pieninä paloina geeninkuljettimena eli vektoina toimuvaan bakteeriplasmidiin. • Vektoreina voidaan käyttää myös viruksia bakteriofageina siirtävät DNA: ta bakteerisoluun transduktion avulla. Koralli 5

Genominen geenikirjasto Koralli 5

c. DNA-geenikirjasto Koralli 5

Yhdistelmäplasmidin (rekombinantti) rakentaminen ● Sisältää rengasmaisen plasmidin perusrakenteen. ● Yhdelle puolelle rengasta (bakteerissa toimivan geenin säätelyalueen viereen) on siirretty pala vierasta DNA: ta (geeni). ● Mikäli siirrettävä geeni on tumallisesta solusta vaatii muokkauksen. ○ lisätään säätelyalue proteiinia koodaavan alueen viereen ● Toisella puolella vektoria on DNA: n kahdentumisen aloituskohta. ● Antibioottivalinta ○ voidaan tutkia geeninsiirron onnistumista ○ kahdentumisen aloituskohdan viereen lisätään antibioottiresistenssigeeni ○ kasvatetaan bakteereja agarmaljalla, jossa tiettyä antibioottia ○ elossa selviävät ne bakteerit, joilla on antibioottiresistenssigeeni Koralli 5

plasmidin rakenne Koralli 5