INRA Nancy Unit de recherche Pathologie Forestire Deux

INRA Nancy Unité de recherche Pathologie Forestière Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora, agents de la rouille foliaire des peupliers Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon

Les peupleraies 230 000 ha 1, 3% de la surface boisée 2, 2 millions m 3 par an ( chêne) culture clonale : monoclonale / parcelle pauciclonale / région moins de 1 000 ha de 1 000 à 2 500 ha de 2 500 à 5 000 ha plus de 5 000 ha

La rouille foliaire des peupliers Agents pathogènes : Melampsora spp. (Basidiomycètes, Urédinales) urédospores urédies Dégâts: ü défeuillaison intense ü réduction de croissance ü affaiblissement général Pertes économiques importantes

En France, 3 espèces de Melampsora sont pathogènes sur les peupliers cultivés : M. larici-populina, la plus fréquente et la plus agressive M. allii-populina, présente partout en France M. medusae, parasite de quarantaine, essentiellement dans le Sud-Ouest de la France Ouest Centre Sud-Ouest Nord+Est

Cycle de la rouille du peuplier 1 cm 1 mm urédies 1 cm écidies hôte alternant (mélèze) télies hôte principal (peuplier) Identification des espèces à différents stades de développement : ü télien ü écidien ü urédien morphologie très proche entre espèces morphologie distincte entre espèces détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire

Origine géographique des isolats étudiés M. larici-populina (30 isolats) M. allii-populina (28 isolats) 88 isolats étudiés M. medusae (30 isolats)

Les deux outils de biologie moléculaire utilisés Région ITS (Internal Transcribed Spacer) de l’ADN ribosomal I - Analyse de la formation d’hétéroduplex M. larici-populina II - Trois couples d’amorces spécifiques des espèces : M. allii-populina M. medusae ITS 1 -MLP ITS 1 -MM ITS 1 -MAP 17 S ITS 1 100 pb 5, 8 S ITS 4 -MLP ITS 4 -MAP ITS 4 -MM ITS 2 25 S

I - Analyse par formation d’hétéroduplex : PRINCIPE Espèce à déterminer ITS amplifiés (amorces ITS 1 / ITS 4) M. larici-populina M. allii-populina M. medusae 3 ITS de référence dénaturation à 94°C renaturation jusqu’à 25°C homoduplex et hétéroduplex

I - Analyse par formation d’hétéroduplex : MISE EN EVIDENCE Révélation sur gel d’acrylamide à 8% MLP MAP MM + + + MLP MAP MM M MLP MAP + + + MAP MM MM M : marqueur de taille (100 pb) MLP : M. larici-populina MAP : M. allii-populina MM : M. medusae hétéroduplex 700 pb homoduplex Révélation sur gel d’agarose à 1% M MLP MAP MM + + + MLP MAP MM MLP MAP + + + MAP MM MM hétéroduplex homoduplex

I - Analyse par formation d’hétéroduplex RESULTATS : Confrontations des ITS amplifiés des urédospores des 88 isolats avec les 3 ITS de référence ü Formation d’hétéroduplex dans 100% des confrontations interspécifiques (ITS hétérologues) Absence d’hétéroduplex dans 100% des confrontations intraspécifiques (ITS homologues) CONCLUSIONS : ü méthode moléculaire simple et fiable pour l’identification des espèces ü gel d’agarose bien adapté au diagnostic interspécifique en routine ü méthode indirecte d’analyse du polymorphisme de séquence ü pourcentage d’homologie intraspécifique des ITS supérieur à 95%

II - Amorces spécifiques d’espèces : RESULTATS ET CONCLUSIONS M. laricipopulina M 1 2 3 M. alliipopulina M. medusae 4 7 5 6 ITS 1 -MLP / ITS 4 -MLP ITS 1 -MAP / ITS 4 -MAP ITS 1 -MM / ITS 4 -MM 8 9 T Validation sur l’ADN d’urédospores de 88 isolats : ü Les couples d’amorces spécifiques d’espèce permettent l’amplification de l’ADN de 100% des isolats de l’espèce correspondante ü Aucune réaction croisée entre ces 3 espèces n’a été observée La spécificité des amorces est confirmée ITS 1 / ITS 4 Outil d’identification des 3 espèces de Melampsora très fiable

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 1 - identification d’une espèce à différents stades du développement cas de M. larici-populina : écidies sur mélèze télies sur peuplier ü Validation du couple d’amorces sur ces deux stades ü Pas de réaction croisée avec l’ADN de l’hôte

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2 - détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire au stade urédien (peuplier) : cas de M. medusae en mélange avec M. larici-populina ü M. medusae - parasite de quarantaine - espèce peu fréquente - répartition géographique mal expliquée : Sud-Ouest de la France ü M. larici-populina - espèce très majoritaire en France

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2 - détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges d’ADN de M. medusae et de M. larici-populina (10 ng/µl) utilisation des amorces spécifiques de M. medusae [ ADN M. medusae M ] 0, 5 0, 1 0, 05 10 1 10 0, 1 1 ng/µl pg/µl pg/µl T 600 pb Détection de M. medusae dans une solution à 0, 1 pg / µl Seuil de détection de 1 / 100 000 soit l’équivalent de la quantité d’ADN de 6 urédospores dans le mélange

II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2 - détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges de SPORES de M. medusae et de M. larici-populina (extraction de 2 mg de chaque mélange = 800 000 spores) Dilution en cascade Nombre de spores de M. medusae 64000640 64 0 6 3 0 600 pb Détection de 6 urédospores de M. medusae parmi 800 000 urédospores de M. larici-populina Seuil de détection inférieur à 1 / 100 000 Possibilité de détecter une seule urédie de M. medusae sur 100 feuilles de peuplier très infectées par M. larici-populina

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Les amorces spécifiques d’espèces ont montré leur efficacité : pour l’identification de l’espèce quel que soit le stade de développement identification des espèces sur écidies : efficacité du passage de M. larici-populina sur mélèze la détection d’une espèce rare (amorces >>>> microscope) application pour le contrôle du parasite de quarantaine M. medusae, effectué par le LNPV Construction d’amorces spécifiques des 5 espèces de Melampsora des trembles : certaines ont pour hôte altenant le mélèze l’identification au microscope est très difficile, même au stade urédien