Diagnosticul molecular Diagnosticul molecular Tehnici diagnostice ce urmaresc

Diagnosticul molecular

Diagnosticul molecular Tehnici diagnostice ce urmaresc identificarea unor modificari la nivelul moleculelor de ADN sau ARN: - mutatii - polimorfisme - fragmente exogene - “amprenta ADN” – medicina legala Obiective: - Diagnostic pre- si postnatal - Diagnostic presimptomatic - Identificare heterozigoti - Identificare purtatori de premutatii (mutatii dinamice) n - Metode directe – mutatii cunoscute Metode indirecte – identificarea unor markeri genetici inlantuiti cu alele morbide

Tehnici de baza n n n Izolarea ADN genomic Utilizarea enzimelor de restrictie Electroforeza (agaroza, PAGE, camp electric pulsatil) Amplificarea “in vitro” prin PCR Secventarea ADN Hibridizarea fragmentelor de ADN cu probe specifice marcate

Izolarea ADN genomic – principiu/etape n Liza celulara Liza nucleara Digestia moleculelor de ARN (optional) Precipitarea proteinelor (inhibitori ai reactiei PCR) Precipitarea (izolarea) ADN in solutie alcoolica Spalarea (purificarea) cu alcool 70% Rehidratare n Stocare la congelator >>>>> ∞ n n n

Reactia PCR n n - - - Amplificarea fragmentului dorit in miliarde de copii (modelul replicarii ADN “in vivo”) pentru a putea fi ulterior analizat Necesar reactie PCR ADN –ul tinta (genomic sau fragment de ADN obtinut din amplificare anterioara– nested PCR) Taq-polimeraza Mix d. NTP (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP) Primeri (amorse) specifice, complementare pe cele doua catene (Fw si Rev) Mg. Cl 2 Buffer pentru Taq polimeraza Termocycler

Etape PCR n n - Denaturarea initiala a ADN – 94 -95 grade – 5 -10 min. Cicluri (30 -40) de reactie de amplificare: Denaturare 94 -95 grade Legarea amorselor (annealing) – 50 -65 grade Elongarea (sinteza) <Taq-polimeraza> - 72 grade Elongare finala – 72 grade – 5 -10 min. Stocare ampliconi la 4 grade sau congelator pana la prelucrare ulterioara sau direct electroforeza http: //www. dnalc. org/ddnalc/resources/sangerseq. html (Ctrl Right, apoi Open Hyperlink)

Copies at cycle n = Initial copy # x 2 n PCR permite obtinerea unei cantitati analizabile, specifica a regiunii determinate de catre amorse Southern si VNTR : 1 µg, PCR si STR : 1 ng

Tehnica PCR-RFLP n Digestia cu enzime de restrictie a fragmentului amplificat urmata de electroforeza in gel

Metode directe Tehnica RFLP (restriction fragments length polymorphism) Diagnosticul mutatiei C 282 Y in hemocromatoza primara (tip I) Rsa. I n C 282/C 282 Y/C 282 Y 247 pb 140 111 Rsa. I 247 pb 111 pb Rsa. I 29 pb Fragmente amplificate – migrare in gel de agaroza dupa digestie

AS-PCR – amplificare utilizand primeri pt. alela normala, respectiv mutanta

Tehnica Tetra ARMS-PCR

Secventarea automata avand la baza metoda Sanger