Schema tipo di purificazione Lisi cellulare non necessaria

Schema tipo di purificazione • Lisi cellulare (non necessaria in caso di esoenzimi) • Passaggi di chiarificazione • Passaggi di arricchimento e purificazione preliminare a bassa efficienza • Passaggi di purificazione ad alta efficienza

Lisi cellulare • Tipo di cellula • Condizioni di crescita (composizione del brodo di coltura, areazione, fase di crescita)

Lisi cellulare ─ Metodi non meccanici La lisi viene ottenuta mediante la variazione di un parametro chimico-fisico che riesce ad alterare l’integrità delle cellule permettendo la fuoriuscita del materiale citoplasmatico • Trattamento al calore: – 50/70 °C • Congelamento scongelamento: – Azione dell’acqua intracellulare

Metodi non meccanici (termici) Vantaggi • Semplicità • Non necessita di strumentazione particolare • Facile passaggio di scala • • Svantaggi Consumi energetici elevati Scongelamento disomogeneo Tempi operativi lunghi Denaturazione della proteina

Metodi non meccanici • Metodi enzimatici: azione, di solito blanda, di enzimi idrolitici • Lisozima: muramidasi che degrada la parete batterica • Glucanasi, mannasi, cellulasi e pectinasi che degradano la parete cellulare di diversi tipi di cellule Vantaggi: lisi blanda che non danneggia l’enzima da purificare, facile passaggio di scala, nessuna strumentazione particolare Svantaggi: costi degli enzimi litici, tempi operativi piuttosto lunghi, non applicabilità a tutti i tipi di cellule

Metodi non meccanici • Metodi chimici (spesso usati dopo la digestione enzimatica): uso di solventi organici quali toluene, acetone e detergenti ionici (Triton X-100) e non ionici (sali di ammonio quaternario) Vantaggi: alta efficienza di lisi, facile passaggio di scala, protezione battericida Svantaggi: pericolosità per gli operatori e per l’ambiente; necessità di impianti incendio ed anti deflagrazione; costi di smaltimento dei rifiuti

• Metodi meccanici: la rottura cellulare è ottenuta mediante l’applicazione di forze meccaniche – Sonicatori con ultrasuoni – Dispersori meccanici (frullatori ad immersione e waring blender) – Mulini con sfere abrasive – Mortai e pestelli – Cilindri con pistone (potter) – Presse ed estrusori

Sonicatori • Apparecchio che genera ultrasuoni dotato di una sonda che viene immersa nella sospensione cellulare che si vuole lisare Limiti: • l’energia delle onda è tanto maggiore quanto più sottile è la sonda e questo obbliga ad usare volumi di campione piuttosto piccoli (difficoltà di pasaggio di scala, parzialmente risolti utilizzando piccole camere di lisi con alimentazione continua di campione) • Surriscaldamento • Efficienza di lisi variabile a seconda delle cellule utilizzate

Dispersori meccanici e frullatori Agitatore con lame di tipi differenti • Ultra-turrax, in cui la parte statica in acciaio, contenente le lame ed immersa nel campione, è collegata con un motore che permette la rotazione delle lame • Warring blender Limiti: strumentazione difficilmente applicabile a grandi volumi

Mulini con sfere abrasive • Dyno Mill: – camera di lisi contenente un rotore su cui sono montati gli agitatori; – la camera di lisi presenta uno o più punti di caricamento del campione da lisare e delle sferette di lisi; – il rotore è collegato con il motore che trasmette l’agitazione a velocità variabile; – la camera di lisi può essere alimentata in continuo da una pompa; un sistema di separazione permette di trattenere le sferette di vetro lasciando fuoriuscire dalla camera di lisi la soluzione ed i frammenti cellulari

Mulini con sfere abrasive • Potter e Braun: – la camera di lisi contenente palline di vetro e campione da lisare viene agitata vigorosamente con agitazione diretta del mulino; – Al termine il lisato è separato dalle sferette di vetro non essendo il processo in continuo • Vortex

Mulini con sfere abrasive • • • Vantaggi Svantaggi Possibilità di • Rigenerazione delle passaggi di scala sferette Sistemi in continuo • Sanitizzazione della camera di lisi Rese di lisi elevate • Strumentazione tempi rapidi relativamente costosa Basso impatto ambientale

Mortai e pestelli • Macinazione manuale con pestello del campione (eventualmente congelato) addizionato di agenti abrasivi quale sabbia • Procedura strettamente da laboratorio con risultati scarsamente riproducibili

Presse ed estrusori • Applicazione di alte pressioni (200 -1000 bar) in presenza (Hughes press) o assenza di abrasivo (French press) • Le cellule possono essere sottoposte a forze frizionali additive (passaggio attraverso un sottile orifizio di una valvola) • Controllo della temperatura mediante sistemi di raffredamento Vantaggi: – applicazioni industriali su larga scala mediante sistemi in continuo; – Rese molto elevate anche grazie alla possibilità di ripetere la lisi facendo ricircolare in continuo la sospensione cellulare Svantaggi: – Cautele derivanti dall’uso di altre pressioni – Strumentazione costosa

Determinazione dell’efficienza di lisi • Controllo microscopico e/o valutazione della crescita microbica: – Conteggio del numero di cellule intere visibili previa colorazione al microscopio ottico e/o conteggio delle colonie microbiche crescono su piastre Petri con terreni di coltura, prima e dopo la lisi (percentuale di rottura)

Determinazione dell’efficienza di lisi • Determinazione del rilascio di proteine (enzimi) mediante saggi di attività enzimatica R=Af/Ai x 100 dove: Af attività finale; Ai attività iniziale o totale ricavabile in modo semplice nel caso in cui l’enzima in questione sia dosabile direttamente nelle cellule o acquisibile considerando qualsiasi metodica di estrazione, anche se solo su scala di laboratorio, che riesca a dare una lisi completa o comunque elevata che rappresenterà il traguardo massimo ottenibile da qualsiasi altro approcci si voglia sperimentare