Schema tipo di purificazione Lisi cellulare Passaggi di

Schema tipo di purificazione • Lisi cellulare • Passaggi di chiarificazione • Passaggi di arricchimento e purificazione preliminare a bassa efficienza • Passaggi di purificazione ad alta efficienza

Centrifugazione • La tecnica di centrifugazione si basa sul comportamento di una particella in un campo centrifugo applicato, ed è una metodica di separazione che sfrutta la sedimentazione differenziata di particelle differenti per dimensioni, forma e densità, disperse in una sospensione liquida

• La velocità di sedimentazione dipende da una serie di parametri non solo relativi alla particella stessa, ma anche dal medium di sospensione, dalla sua viscosità, nonché ovviamente dalla forza di gravità applicata, incrementata artificialmente in modo da sedimentare particelle in tempi brevi

• La velocità di sedimentazione è proporzionale al campo centrifugo applicato, funzione a sua volta della velocità angolare del rotore e della distanza della particella dall’asse di rotazione G=ω2 r, dove G è il campo centrifugo applicato, diretto radialmente verso l’esterno, ω è la velocità angolare (radianti/sec), di solito espressa come rivoluzioni per minuto(rpm) per cui ω=2π x rpm/60 r è la distanza radiale (cm), delle particelle dall’asse di rotazione

• Nella pratica si usa il campo centrifugo relativo, utile in quanto permette di esprimere il campo centrifugo come multiplo della costante gravitazionale, pari a 980 cm/sec 2 Il campo centrifugo può quindi essere così espresso RCF (g) =1. 11 x 10 -5 rpm 2 r

Centrifughe • • • A bassa velocità (max 6000 -7000 rpm) Ad alta velocità (max 24000 -25000 rpm) ultracentrifughe (max 60000 -70000 rpm) Rotori • Ad angolo fisso • A bracci oscillanti • A flusso continuo

Centrifugazione • Differenziale: una sospensione omogenea del campione viene centrifugata ad una velocità e per un tempo tali da permettere la completa sedimentazione delle particelle con densità e dimensioni maggiori. Il sovranatante contenente tutte le particelle non sedimentate può essere recuperato, centrifugato una seconda volta ad una velocità maggiore o a tempi più lunghi recuperando un secondo sedimento ed un ulteriore sovranatante. . . e così via

Centrifugazione su gradiente di densità • Zonale: il campione viene stratificato su un gradiente di densità preventivamente preparato nel tubo da centrifuga; la densità aumenta verso il fondo della provetta; il campione ha densità maggiore della densità del gradiente; la centrifugazione viene condotta finché si ha una separazione dei componenti in bande lungo il gradiente, in funzione della loro velocità di sedimentazione e della densità che incontrano migrando verso il fondo della provetta; la frazione di interesse potrà essere recuperata in maniera adeguata; è importante non raggiungere una completa sedimentazione della frazione desiderata

• isopicnica (di uguale densità): Il campione viene risospeso in una soluzione avente la stessa densità del campione; nel caso di gradienti, il campione è stratificato sulla sommità di un gradiente il cui intervallo di densità comprende quella del campione; Il tempo di centrifugazione non influenza la separazione dei componenti

Gradienti • Discontinui: stratificazione di soluzioni a densità decrescente dal fondo verso la sommità del tubo da centrifuga; dipende da quante soluzioni vengono utilizzate; vi è comunque sempre discontinuità di densità tra due regioni contigue del gradiente • Continui: utilizzo di formatori di gradienti utilizzando due soluzioni corrispondenti alla densità massima e minima del gradiente

La centrifugazione nella pratica industriale • Processamento in continuo di grandi volumi • Tempi rapidi di esecuzione • Possibilità di operare in condizioni di sterilità • Possibilità di automazione • Investimento iniziale rilevante • Consumo energetico non trascurabile • Frazione solida separata spesso piuttosto umida • Non totale eliminazione delle particelle solide

Tipi di centrifughe industriali • Tubolari: modelli più semplici, max 18000 g, volumi non troppo grandi, campioni a basso contenuto di fase solida, spesso manca lo scarico continuo della fase solida • A camere: varianti dei modelli tubolari, hanno modifiche della camera del rotore che consente buone sedimentazioni • A dischi: buona efficienza di separazione di volumi anche molto grandi (100 mc/ora), automazione dello scarico, sterilizzazione con vapore, camera di rafreddamento del prodotto • Decanter: basse velocità, grandi capacità (diverse centinaia di metri cubi/ora), effecaci con elevato contenuto di fase solida (fino al 70%), automazione della strumentazione