Schema tipo di purificazione Lisi cellulare non necessaria

Schema tipo di purificazione • Lisi cellulare (non necessaria in caso di esoenzimi) • Passaggi di chiarificazione • Passaggi di arricchimento e purificazione preliminare a bassa efficienza • Passaggi di purificazione ad alta efficienza

Vantaggi e svantaggi • • Rese molto alte • Procedure operative non complesse • Strutture tecnologiche ed impiantistiche non costose Bassa eficienza di purificazione (incrementi di attività specifica medio-bassi)

Trattamenti preliminari (non prevedono la precipitazione delle proteine) • Frazionamento mediante filtrazione – Non richiedono la gestione di un precipitato solido, la sua separazione e risospensione – Sono applicabili quando il materiale da separare ha peso molecolare molto alto o molto basso, facilmente separabile dalla miscela di altri componenti

Trattamenti preliminari (precipitazioni delle proteine) • • • Variazioni del valore di p. H Riscaldamento della soluzione Precipitazione con sali inorganici Trattamento con solventi organici Precipitazione con PEG e altri polimeri miscibili con acqua

Criteri di scelta • Conoscenza delle caratteristiche chimico-fisiche dell’enzima da purificare – Termostabilità – Punto isoelettrico – Possibili effetti denaturanti ed inibitori derivanti dall’aumento della forza ionica e dal tipo di sali usati – Possibili effetti denaturanti ed inibitori derivanti dai solventi e dai polimeri utilizzati • Accurate prove preliminari

Variazione di p. H • Dipendenza della solubilità delle proteine dal valore di p. H (alterazioni delle interazioniche e legami idrogeno che permettono alla proteina di rimanere in soluzione con uno stato minimo di energia e conseguente diminuzione dell’acqua di solvatazione) • Effetto massimo al punto isoelettrico della proteina (assenza di fenomeni di repulsione e conseguente precipitazione) • Conoscenza del punto isoelettrico o almeno dell’intervallo di stabilità dell’enzima • Importanza dell’agitazione per evitare brusche variazioni di p. H locali

Riscaldamento della soluzione • Denaturazione di molecole termolabili, precipitazione, separazione meccanica ed eliminazione del precipitato

Precipitazione con sali inorganici • Salting in: aumento della solubilità delle proteine a basse concentrazioni di sali • Salting out: perturbazioni delle interazioni molecolari in soluzione (neutralizzazioni di cariche e sottrazione dell’acqua di solvatazione) ad alte concentrazioni saline conseguente precipitazione delle stesse senza alterarne l’attività • Sali tipicamente utilizzati: Na. Cl, solfato di sodio e di ammonio, sali di calcio e magnesio • Possibilità di eseguire precipitazioni frazionate con differenti concentrazioni in più passaggi

Precipitazione con solfato di ammonio • Economico, facilmente reperibile con un buon grado di purezza, molto solubile anche a basse temperature e a elevate molarità, stabilizza le proteine prevenendone la denaturazione, batteriostatico • Importanza della diluizione del materiale di partenza • Separazione meccanica del precipitato, risospensione del precipitato ed eliminazione mediante dialisi del sale • Svantaggi nell’uso su scala industriale: grandi quantità di sali necessari per volumi di soluzioni industriali, problemi di incrostazioni e di smaltimento del sale dopo la dialisi

Trattamento con solventi organici • le proteine sono macroioni la cui forza di attrazione è inversamente proporzionale alla costante dielettrica del mezzo disperdente • I solventi organici abbassano la costante dielettrica dell’acqua diminuendo la solubilità proteica • Solventi organici magiormente utilizzati: acetone, metanolo, rimossi dopo la precipitazione mediante evaporazione • Principali limiti: solventi spesso tossici, infiammabili, spesso anche agenti denaturanti delle proteine

Precipitazione con polietilenglicole (peg) e altri polimeri miscibili con acqua • Principio analogo alla floculazione e coagulazione • Polimeri non denaturanti per le proteine, facilmente reperibili, a peso molecolare variabile, facilmente eliminabili dopo la separazione meccanica del precipitato