ESERCITAZIONE 1 PASSAGGIO DI CELLULE IN COLTURA SCOPO

ESERCITAZIONE #1: PASSAGGIO DI CELLULE IN COLTURA SCOPO: diluire cellule ad elevata confluenza per consentirne la proliferazione e mantenerle in coltura per lunghi periodi

Stabilire il grado di CONFLUENZA della coltura

Si possono osservare: Cellule in mitosi Cellule in apoptosi (morte cellulare)

Fibroblasti

Cellule epiteliali (cheratinociti)

Prima di inziare: 1) Riscaldare tutte le soluzioni nel bagnetto termostatato a 37°C. 2) Aprire la cappa a flusso laminare e mettervi tutto il necessario. 3) Sotto cappa, preparare il terreno completo in provetta Falcon da 50 ml: terreno DMEM 10% V/V di siero (FCS) 1% V/V di antibiotici Penicillina + Streptomicina V tot = 50 ml

1 Prendere la flask contenente le cellule dall'incubatore, chiudere il tappo ed osservare il grado di confluenza delle cellule al microscopio 2 Sotto la cappa a flusso laminare, aspirare il terreno con una pipetta da 5 ml e mettere nella flask 5 ml di PBS (SOLUZIONE FISIOLOGICA) sterile per lavare via il terreno (facendo attenzione a non staccare le cellule). 3 Aspirare il PBS e mettere nella flask 1 ml di tripsina/EDTA. Rimettere la flask nell'incubatore e attendere 5 minuti che la tripsina agisca. 4 Sbattere leggermente la flask per staccare bene le cellule dal fondo, osservare al microscopio: le cellule appariranno TONDEGGIANTI E GALLEGGIANTI; se necessario incubare ulteriormente.

5 Mettere nella flask 4 ml di terreno (DMEM+10% FCS+Pen/Strep) in modo da neutralizzare la tripsina. Risospendere bene le cellule spipettando. 6 Si dovranno diluire le cellule ad una concentrazione stabilita, pertanto andranno prima contate. 7 Trasferire la sospensione cellulare in provetta Falcon da 15 ml Centrifugare 5 minuti a 1000 rpm. 8 Aspirare il terreno + tripsina, risospendere DELICATAMENTE il pellet. Mettere nella provetta 5 ml di terreno e risospendere spipettando.

Conta delle cellule: emocitometro (cameretta di Neubauer) Un emocitometro contiene 2 camere (A), ciascuna divisa in 9 quadrati (B) principali del volume di 0. 1 mm 3 = 1 x 10 -4 ml ciascuno (0. 1 l) 1 mm La concentrazione delle cellule è determinata contando il numero di cellule in un’area definita di volume noto. 1 mm 0. 1 mm Quindi: n° di cellule in 1 ml di sospensione = n° di cellule in un quadrato (B) (di vol 1 x 10 -4 ml) moltiplicato per 104

8 Con la micropipetta (p 200), trasferire una goccia della sospensione cellulare nell’emocitometro 9 Procedere alla conta delle cellule al microscopio ricordando: n° di cellule in 1 ml di sospensione = n° di cellule in un quadrato grande x 104 10 • Decidere la CONCENTRAZIONE finale (= numero di cellule per ml di terreno), ad es. 5 x 104/ml. • Decidere il volume finale della coltura, in questo caso 5 ml in 1 capsula Petri da 60 mm di diametro • Procedere quindi alla diluizione della sospensione madre e piastrare le cellule nel contenitore (piattino o flask). 11 Controllare le cellule al microscopio ed infine mettere la capsula Petri (SCRIVERE NOME E DATA) nell'incubatore.

PROBLEMA: LA DILUIZIONE Se ho una sospensione contenente 2 x 105 cellule/ml quanti ml dovrò usarne per preparare 5 ml di una sospensione con 2 x 104 cellule/ml? Se ho una sospensione contenente 2 x 105 cellule/ml (concentrazione INIZIALE), quanti ml (volume INIZIALE = X) dovrò usarne per preparare 5 ml (volume FINALE) di una sospensione con 2 x 104 cellule/ml (concentrazione FINALE)? SOLUZIONE: Vf x Cf = Vi x Ci X ml x 20 x 104 cellule/ml = 5 ml x 2 x 104 cellule/ml 10 x 104 cellule X= 20 x 104 cellule/ml = 0, 5 ml

Buone pratiche La maggior parte degli esperimenti che “non vengono”, falliscono a causa di un errore dello sperimentatore. Alcune regole per imparare a lavorare in modo preciso e quindi incrementare di molto le probabilita’ di successo 1. Riportare accuratamente le condizioni dell’esperimento 2. Mettere sempre la DATA 3. Conservare e marcare chiaramente i risultati (lastre, foto, files)

Quaderno di laboratorio / Lab Notebook • Progetto • Finalita’ • Procedura sperimentale • Risultati • Discussione

Responsabile progetto Ricercatore Controfirmatario Progetto: ________ Data: _______ Da pag. Ogni settimana il ricercatore fa firmare al resposabile del progetto ed al controfirmatario. Una volta all’anno: Notebook viene microfilmato e archiviato Raw data: Se i dati sono incollati sul notebook, si firma attraverso per “sigillo” Per altri dati (e. g. lastre), questi vanno conservati in folder, datati, e cross-indicizzati con il quaderno Le immagini/dati digitali vanno salvati su HD centralizzati, ordinati per data e crossindicizzati con il quaderno. Il notebook non esce MAI dal lab Pag. 3 A pag. Quando il ricercatore se ne va: il notebook resta in laboratorio, e si lascia una directory con tutte le indicazioni sui reagenti, costrutti, e risultati.

Progetto: espressione di p 53 in tumori della cervice Da pag. 2 Data: 24/12/03 Estrazione RNA dai seguenti campioni : 1 - cellule He. La (~ 10 6) 2 - paziente 1 A 5 (biopsia) 3 - paziente 1 A 14 “ 4 - paziente 2 A 31 “ (N. B. scongelato !!!) Usando metodo TRIZOL, secondo protocollo XYZ. --> Campioni risospesi in 0. 3 ml dd. H 2 O Analizzati 20 ul di ciascun RNA mediante elettroforesi in agarosio 1. 5 % 1 2 3 4 Campioni 1 -3 ---> OK! Campione 4 degradato --> ottenere nuova biopsia? -3 - A pag. 5