Ractions dimmunoprcipitation quipe pdagogique du lyce Jean MOULIN

Réactions d’immunoprécipitation Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) GRELIER – DURAND - POCHET

Définition Ag solubles + Ac précipitants spécifiques Formation de complexes immuns Conditions optimales : �Antigène multivalent �Anticorps spécifique �Rapport de concentration optimum : équivalence �Conditions physicochimiques adaptées (p. H, force ionique …) Formation d’un réseau tridimensionnel Précipité : insoluble, visible 2

Phénomène de zone : mise en évidence Expérience de précipitation quantitative Quantité fixe d’anticorps dans chaque tube Ajout de quantités croissantes d’antigène sous un volume constant Apparition d’un précipité : Ø augmentant avec la quantité ajoutée d’antigène Ø diminuant avec les fortes concentrations d’antigène 3

Phénomène de zone : mise en évidence Expérience de précipitation quantitative Sur les surnageants de l’expérience précédente 1 : ajout d’Ac 1 1’ 2 Excès d’anticorps 1’ : ajout d’Ag 2’ 3 3’ Équivalence 4 4’ 5 5’ Excès d’antigène 4

Phénomène de zone : base théorique Quantité de précipité Zone d’excès d’Ac : formation de quelques immuns complexes solubles Zone d’excès d’Ag : formation de quelques immuns complexes solubles Concentration de l’antigène Zone d’équivalence : association des immuns complexes réseau insoluble précipitant 5

Phénomène de zone : variations en fonction de la nature de l’Ag Excès d’Ac Excès d’Ag Ø Courbe verte : antigènes protéiques phénomène de zone marqué zone d’équivalence étroite Ø Courbes rose et noire : antigènes polysaccharidiques phénomène de zone très atténué 6

Réactions de précipitation en milieu gélifié Ø Réaction au sein d’un gel transparent (0, 5 à 1% d’agarose purifié) Ø Diffusion des Ag et/ou Ac à partir d’un puits : formation de gradients de concentrations continus Ø Pas de diffusion des complexes immuns : précipitation du réseau Ø Lecture : § Directe par apparition de zones de précipitations opaques (arcs, cercles…) § Indirecte après lavage et coloration 7

Classification des réactions de précipitation en milieu gélifié Diffusion double Diffusion simple (qualitative) (quantitative) Localisation des Ac diffusant à partir d’un puits présents dans le gel Localisation des Ag diffusant à partir d’un puits Diffusion non accélérée Ouchterlony Mancini Diffusion accélérée électriquement Electrosynérèse Laurell 8

Technique d’Ouchterlony Immunodiffusion double non accélérée Identité complète Non identité Identité partielle 9

Electrosynérèse Immunodiffusion double accélérée par un champ électrique Sens des électrons Ac n Ag n - + Ac n Installation du gel dans une cuve d’électrophorèse Application d’un courant pour accélérer la diffusion naturelle Migration n Ag n Ac Ag 1/2 n Ac Ag 1/4 + Sens des électrons rapide des antigènes vers l’anode des anticorps cathode. vers la Formation d’un arc de précipitation à l’équivalence.

Electrosynérèse : mobilité électrophorétique p. H tampon < p. Hi protéines chargées + Charge p. Hi + 0 - p. H tampon > p. Hi protéines chargées - p. H tampon : 8, 6 p. H majorité des protéines chargées – (p. Hi < 8, 6) migration électrophorétique vers l’anode dépôt de l’antigène côté cathode

Electrosynérèse : mobilité des Ag et des Ac Courant d’électroendosmose : - déplacement de cations mobiles et d’eau de l’anode vers la cathode - créant un courant d’entraînement s’opposant au courant électrophorétique Antigènes : p. Hi souvent << 8, 6 charges - nombreuses Mobilité électrophorétique Ag + Anode Courant d’electroendosmose Mobilités nettes Ac Cathode Anticorps : p. Hi légèrement < 8, 6 charges - limitées

Technique de Mancini Immunodiffusion simple non accélérée 13

Technique de Laurell Immunodiffusion simple accélérée par champ électrique n Ag n Ac - + n Ac Ag 1/2 Ag Ag 1/4 + Sens des électrons - n Installation du gel dans une cuve d’électrophorèse Application d’un courant pour accélérer la diffusion naturelle Migration rapide des Ag vers l’anode Formation d’une fusée (rocket) de précipitation à l’équivalence h (hauteur des rockets en mm) Sens des électrons

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2. 1 – Précipitation en milieu liquide 2. 1. 1 – Test de l’anneau ◦ Technique qualitative ◦ Superposition des deux solutions Ag et Ac ◦ Apparition d’un anneau à l’interface Solution d’anticorps Apparition d’un anneau de précipitation à l’interface des deux solutions Solution d’antigène 15

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations Rayons lumineux focalisés Source lumineuse 2. 1 – Précipitation en milieu liquide 2. 1. 2 – Immunonéphélémétrie ◦ Technique quantitative ◦ Traversée du mélange par un faisceau lumineux monochromatique de haute intensité ◦ Mesure de la diffraction de la lumière provoquée par les immuns complexes Solution antigénique + Solution d’anticorps spécifiques Rayons lumineux diffractés Capteur 16

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2. 1 – Précipitation en milieu liquide 2. 1. 2 – Immunoturbidimétrie • • • Technique quantitative Traversée du mélange par un faisceau lumineux Mesure, au spectrophotomètre, de l’absorbance de la lumière par les immuns complexes (lumière absorbée et transmise) Mesure de la lumière diffractée = Néphélémétrie Récapitulatif Mesure de la lumière transmise = Turbidimétrie

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2. 2 – Précipitation en milieu gélifié 2. 2. 2. 1 – Immunodiffusion simple unidimentionnelle : Technique en tube de OUDIN Dépôt de l’antigène Gradient de concentration de l’antigène Gel contenant l’anticorps Zone d’équivalence Hauteur entre l’interface et le précipité définie par : H = k x log [Ag] x √t 18

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : principe 1 - Séparation électrophorétique des antigènes déposés dans un puits creusé dans un gel d’agarose Dépôt des antigènes dans les puits ++ Gel d’agarose Séparation électrophorétique -

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : principe 2 - Dépôt des anticorps dans une gouttière creusée parallèlement au trajet de migration Dépôt des anticorps dans la gouttière

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : principe 3 - Diffusion double créant des arcs de précipitation correspondant aux réseaux d’immuns complexes colorés pour une meilleure visualisation Diffusion double durant 24 heures

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3. 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : résultats 1 2 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 3 4 5 6 78 9 10 11 12 Préalbumine (0, 28 -0, 35) Albumine (35 -45) Orosomucoïde (0, 75 -1) α 1 antitrypsine (2 -5) α 1 antichymotrypsine (α 1 lipoprotéine)(2 -3) OC globuline Haptoglobine (0, 3 -2) Céruléoplasmine (0, 25 -0, 4) 13 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 14 15 16 Alpha 2 macroglobuline Hémopexine Transferrine βlipoprotéine β C/A complément Ig. A Ig. M β glycoprotéine 1 Ig. G 17 (2, 2 -2, 8) (0, 8 -1) (2 -3) (0, 35) (1 -3) (0, 7 -1, 7) (8 -15)

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3. 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse : exemples Résultat normal Augmentation de l’arc avec les anti-Ig. G Augmentation de l’arc avec les anti-kappa 23

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3. 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunofixation : principe et résultat 1 - Séparation électrophorétique des antigènes déposés sur une « piste » de gélose 2 – Dépôt des anticorps sur la piste de migration : précipitation des IC 3 – Lavages : élimination des Ag non précipités 4 – Coloration des précipités d’immuns complexes formés formant des bandes étroites Résultat d’un cas identique à l’IEE

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3. 2. 2. 3 - Immunoélectrodiffusion Immunofixation : principe et résultat Avantages rapidité d’exécution (2 heures) facilité de lecture (bandes bien nettes et non arcs très fins) Inconvénient autant de dépôts qu’il y a d’anticorps à tester Résultat d’un cas identique à l’IEE