La regolazione dellespressione genica Tutte le cellule di

La regolazione dell’espressione genica Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima frazione è attiva in ogni cellula; per esempio, in una cellula delle isole del pancreas è attivo il gene per l’insulina, non quelli per l’emoglobina (attivi nelle cellule dei midollo osseo, progenitrici dei globuli rossi) o per la pepsina (attivi nelle cellule della mucosa gastrica) Durante lo sviluppo embrionale di un organismo multicellulare, le cellule destinate a costituire i diversi tessuti e organi attivano in momenti precisi i geni che codificano le proteine che stimolano o inibiscono la proliferazione cellulare e quelle caratteristiche del tessuto in formazione (per esempio osseina per le ossa, cheratina per la pelle) Anche gli organismi unicellulari hanno bisogno di attivare alcuni geni solo in particolari circostanze (per esempio la presenza di un nutrimento che richiede particolari enzimi) per non sprecare l’energia e le molecole necessarie Le cellule tumorali hanno perduto, anche in seguito a mutazioni somatiche, la capacità di regolare l’espressione genica relativa alle proteine che controllano la proliferazione cellulare Dunque nelle prossimità dei geni ci devono essere recettori in grado di percepire segnali provenienti dall’ambiente esterno e veicolati all’interno della cellula; tali recettori devono quindi segnalare ai geni se trascrivere o no, in funzione dei segnali provenienti dall’esterno

Il sistema lac in E. coli HOC 6’H 2 C 5’ OH O O H C 4’ H Lattosio OH H C 3’ C 2’ H OH C 1’ C 4’ H H OH C 2’ OH H OH C 5’ O HOC 6’H 2 b-galattosidasi O C 5’ OH H C 1’ OH H C 3’ H Galattosio C 3’ HOC 6’H 2 C 4’ H OH C 1’ HOC 6’H 2 C 5’ H H H O OH H C 4’ OH C 1’ OH H C 2’ C 3’ C 2’ OH H OH Glucosio H + H 2 O L’enzima b-galattosidasi, che consente di utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e di energia, viene sintetizzato in presenza di lattosio che quindi oltre che esserne il substrato è anche l’induttore della sua sintesi Dal lattosio è indotta la sintesi di altri 2 enzimi: permeasi e transacetilasi; anche la permeasi è coinvolta nel metabolismo del lattosio, poiché facilita l’ingresso del lattosio nella cellula.

I geni strutturali e il gene I I Z Y I+ = allele normale: Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore; I- = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre; Is = allele inibente la risposta all’induttore: Z, Y, A non trascrivono mai A trascrizione Merodiploidi per definire le relazioni funzionali tra gli alleli Un unico m. RNA policistronico traduzione I+Z-/I-Z+ I-Z-/I+Z+ b-galattosidasi transacetilasi I-Z-/I-Z+ Trascrive* sempre Is. Z+/I+Z+ Non trascrive mai Is. Z+/I-Z+ Non trascrive mai F’(lac) permeasi Geni lac 1) Is è dominante su I+ che a sua volta è dominante su I- Trascrive* con l’induttore *un m. RNA per un enzima funzionale 2) I+ è dominante su I- indipendentemente dalla posizione in cis o in trans rispetto a Z+

Operatore, promotore e operone I P O Z Y A operone O+ = allele normale: Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore; Oc = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre O+Z+/Oc. Z+ Trascrive* sempre O+Z+/Oc. Z- Trascrive* con l’induttore O+Z-/Oc. Z+ Trascrive* sempre Is. O+Z+/I+Oc. Z+ Trascrive* sempre Il prodotto del gene I è una proteina diffusibile che, in assenza dell’induttore, si lega ad O e impedisce la trascrizione di Z, Y , A; in presenza dell’induttore non si lega ad O e consente la trascrizione di Z, Y, A *un m. RNA per un enzima funzionale 1) Oc è dominante su O+, ma solo in cis rispetto a Z+ (cis-dominanza) 2) Gli alleli normali di P sono cis-dominanti sui mutanti difettivi di P, che impediscono incondizionatamente la trascrizione di Z, Y, A, impedendo l’inserimento della RNA polimerasi

Controllo negativo dell’espressione genica nell’operone lac RNA polimerasi I P O Z Y A induttore m. RNA I I- Is Oc P- P O Z I P O Z Y A repressore non legato all’induttore, che si lega ad O e impedisce la trascrizione repressore legato all’induttore, che non si lega ad O e non impedisce la trascrizione repressore I- senza affinità per O, con cui non si lega mai e non impedisce mai la trascrizione repressore Is senza affinità per l’induttore, che si lega sempre ad O e impedisce sempre la trascrizione operatore senza affinità per il repressore che non lega mai e non impedisce mai la trascrizione promotore senza affinità per l’RNA polimerasi che impedisce sempre la trascrizione

Controllo positivo dell’espressione genica nell’operone lac c. AMP si lega a una proteina attivatrice (CAP). P O Z RNA polimerasi CAP Y A basse concentrazioni di glucosio aumenta la concentrazione di AMP ciclico (c. AMP). A m. RNA Il complesso CAP-c. AMP si lega al promotore e ne aumenta l’affinità per l’RNA polimerasi… …e, in presenza di lattosio, che “blocca” il repressore, … c. AMP …intensifica la trascrizione di Z, Y ed A. Controllo negativo dell’espressione genica nell’operone trp P O trp. E trp. D triptofano RNA polimerasi m. RNA trp. C trp. B trp. A repressore non legato al triptofano, che non si lega ad O e consente la trascrizione repressore legato al triptofano, che si lega ad O e non consente la trascrizione

Organizzazione della cromatina e controllo della trascrizione negli eucarioti Nei nuclei in interfase i cromosomi hanno domini separati, che si possono vedere con sonde specifiche Le regioni che devono trascrivere si spostano alla superficie dei domini L’acetilazione degli istoni, mediata dalle proteine attivatrici e da trans-acetilasi, allenta il legame con il DNA, che diventa accessibile ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi attivatore transacetilasi deacetilasi HO La metilazione degli istoni compatta la cromatina e rende il DNA inaccessibile C H 3 metile C CH 2 acetile O Terminata la trascrizione, gli istoni sono deacetilati con l’azione di una deacetilasi e si ripristina il legame DNA-istoni nei nucleosomi, tornando alle condizioni di riposo.

Regolazione della trascrizione negli eucarioti: promotore e intensificatori Regioni regolatrici dei geni eucariotici Regioni Sequenze, Funzioni Posizioni Regione centrale del promotore TATA box Legame con fattori di trascrizione, RNA polimerasi II 25 -30 nucleotidi a monte Promotore (altre regioni) CAAT box e/o GC box Legame con fattori di trascrizione (generali e specifici) Distanze varie, a monte Intensificatori Varie Legame con proteine attivatrici, modificazione della cromatina Varia Attivatori Complesso di fattori di trascrizione Intensificatore RNA polimerasi II CAAT box TATA box

Inattivazione a lungo termine della trascrizione negli eucarioti: eterocromatina costitutiva e facoltativa Le regioni cromosomiche con la cromatina compatta sono visibili nei nuclei in interfase come zolle più colorate e costituiscono l’eterocromatina Il compattamento avviene con l’avvolgimento dei nucleosomi a formare il solenoide… …e con il ripiegamento della cromatina sulla matrice. Le regioni con DNA satellite non hanno geni, non trascrivono mai e sono sempre compatte (eterocromatina “costitutiva”) Il cromosoma X inattivo rimane condensato in interfase (eterocromatina “facoltativa”), ove è visibile come “corpo di Barr”. HH H H N Durante le fasi precoci dell’embriogenesi uno dei 2 cromosomi X di femmine di mammifero è inattivato a caso in ciascuna cellula somatica e l’inattivazione è ereditata dalla discendenza cellulare; i tessuti somatici femminili sono mosaici clonali “epigenetici”, cioè d’espressione genica. C H H C C C H N C O C La metilazione della citosina nel DNA in sequenze 5’CG 3’ è connessa con l’inattivazione del cromosoma X

Inattivazione a lungo termine della trascrizione negli eucarioti: l’imprinting genomico Durante la gametogenesi sono inattivati alcuni geni specifici, che sono diversi nelle cellule germinali maschili e femminili (“imprinting genomico”). Disomia uniparentale geni inattivati nei gameti maschili geni inattivati nei gametifemminili Nelle fasi precoci dello sviluppo embrionale l’inattivazione viene rimossa nella linea germinale La metilazione della citosina nel DNA in sequenze 5’CG 3’ è connessa con l’imprinting genomico La metilazione della citosina nel DNA in sequenze 5’CG 3’ è connessa infine con l’inattivazione di geni ad azine tessuto-specifica Zigote bilanciato geneticamente (tutti i geni in 2 copie) ed epigeneticamente (almeno una copia attiva di tutti i geni). Zigote bilanciato geneticamente (tutti i geni in 2 copie) ma sbilanciato epigeneticamente (almeno ungene non ha una copia attiva).

Il controllo dopo la trascrizione negli eucarioti Controllo quantitativo: l’interferenza da RNA Complesso RISC Complesso DICER si. RNA trascrizione 1) Un breve (70 nucleotidi) RNA a doppio filamento viene tagliato da DICER 2) Un dei 2 filamenti complementari residui (21 nucleotidi), detto si. RNA, si lega a RISC mi. RNA 1) Un breve (70 -130 nucleotidi) RNA a forcina viene tagliato da DICER 3) si. RNA-RISC si appaia a una regione complementare di uno specifico m. RNA e lo frammenta m. RNA 4) I frammenti dell’m. RNA sono degradati m. RNA 3) Un dei 2 filamenti complementari residui (19 -24 nucleotidi), detto mi. RNA, si appaia a una regione complementare all’estremità 3’ non tradotta di uno specifico m. RNA e ne blocca la traduzione

Il controllo della traduzione negli eucarioti b-tubulina …. …. . -Argaan. Glu-Ile -aa 5 - aa 6 -Met 5’ AUG AAAA 3’ In assenza/bassa concentrazione di b-tubulina, la traduzione dell’m. RNA della b-tubulina procede fino al completamento e il rilascio del polipeptide. b-tubulina …. Met-Arg-Glu-Ile 5’ AUG AAAA 3’ RNasi In presenza di concentrazioni alte di b-tubulina, la traduzione dell’m. RNA della b-tubulina è bloccata dal legame che si crea tra alcuni aminoacidi centrali della b-tubulina già presente nel citoplasma con i primi 4 aminoacidi della b-tubulina nascente; tale complesso induce l’azione di una Rnasi che taglia e degrada l’m. RNA legato al ribosoma.

Un gene più catene polipeptidiche? “editing” dell’m. RNA Cambiamenti nella sequenza degli m. RNA possono avvenire per inserzione/delezione di base (p. es m. RNA mitocondrali) UUUU m. RNA Cambiamenti nella sequenza degli m. RNA possono avvenire per isostituzione di base (p. es m. RNA dell’apolipoproteina B nell’intestino umano) Esoni “costitutivi” m. RNA U AA C “splicing” alternativo pre-m. RNA Introni Esoni “facoltativi” m. RNA alternativi Al gene SLO nell’uomo sono attribuiti 500 possibili m. RNA nelle cellule della coclea Al gene Dscam in Drosophila sono attribuiti più di 30. 000 possibili m. RNA nei neuroni

Splicing alternativo: determinazione del sesso in Drosophila X Y Sxl X X Tra AUG UAG AUG UGA SXL UAG UGA pre-m. RNA Polipetide tradotto TRA- Dsx AUG UGA DSX m Differenziamento maschile AUG UAG pre-m. RNA Polipetide tradotto UGA DSX f Differenziamento femminile UAG

Ingegneria genetica Le tecniche dell’ingegneria genetica permettono di isolare un gene che codifica per una determinata proteina e di inserirlo, mediante dei vettori adatti, nel genoma di un altro organismo. Queste tecniche sono state applicate al campo della medicina per la produzione farmaci, per la diagnosi di malattie genetiche, per la progettazione di vaccini. In agricoltura si stanno progettando piante e animali transgenici, per aumentarne la produttività e migliorarne la qualità. Ma tutto ciò pone problemi nuovi di carattere etico, economico, biologico che devono essere attentamente valutati per la tutela della vita e dell’ambiente. Batterio Cromosoma batterico Plasmide isolato Plasmide Copie del gene isolato Cellula contenente il gene da isolare DNA purificato Gene da isolare DNA ricombinante (plasmide) Inserimento del plasmide nella cellula batterica Batterio ricombinante duplicazione Copie delle proteine come ad esempio insulina, ormone della crescita

Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi capaci di tagliare il DNA producendo rotture a doppia elica in corrispondenza di sequenze specifiche di nucleotidi (siti di restrizione); di essi si servono i batteri per distruggere i cromosomi virali endonucleasi Sito di restrizione Eco. RI 5’GAATTC 3’CTTAAG Hae. III 5’CC GG 3’GGCC Formazione di code 5’CCAA 3’GG GG TT CC Tipo di taglio Sfalsato, adesivo Tronco, non adesivo Un taglio è detto adesivo quando: 1) È sfalsato, o sono aggiunti nucleotidi al 3’; 2) I nucleotidi a singolo filamento, sfalsati o aggiunti, sono fra loro complementari Le estremità di un taglio adesivo si possono unire mediante i legami idrogeno tra le basi complementari presenti a singolo filamento sui 2 segmenti di DNA; successivamente, mediante l’azione di ligasi e, se serve, di DNA polimerasi, si saldano i filamenti polinucleotidici (vedere diapositiva 8) Si possono aggiungere al 3’ di uno dei 2 filamenti di un capo di un taglio tronco, non “adesivo”, una breve sequenza, ripetizione di un solo nucleotide e al 3’ dell’altro capo la sequenza complementare, rendendo adesivo il taglio I siti di restrizione sono brevi sequenze palindromiche: la sequenza posta a un lato rispetto al centro del sito è complementare alla sequenza inversa rispetto a quella posta al lato opposto

Mappe di restrizione Una mappa di restrizione consiste nell’identificazione della successione dei siti di restrizione per diverse endonucleasi in un segmento di DNA, misurando la distanza tra i siti come numero di nucleotidi 1) Si esamina un frammento di DNA, marcandolo con 32 P al 5’ 2) Si digerisce il frammento con diversi enzimi di restrizione Marcatura con 32 P 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso su un gel mediante elettroforesi Siti di restrizione dell’enzima L’elettroforesi consiste nel collocare le macromolecole in un pozzetto all’estremità di un gel (gelatina) che viene poi sottoposto un campo elettrico; le molecole si spostano con una velocità proporzionale alla propria carica elettrica e inversamente proporzionale lla propria lunghezza; poiché nel DNA la carica è distribuita uniformemente, la velocità dipende solo dalla lunghezza del frammento

Il DNA ricombinante VETTORI Sono cromosomi capaci di replicare e selezionabili, in cui si possono inserire segmenti di DNA di interesse DNA da clonare vettore Digestione con endonucleasi DNA polimerasi I + ligasi I vettori possono essere : -plasmidi, -cromosomi di fagil, ibridi fago-plasmide (cosmidi), tutti capaci di replicarsi in E. coli, -YAC, cioè cromosomi artificiali di lievito, capaci di replicarsi in lievito In ogni tipo di vettore si può inserire un frammento di DNA di una particolare lunghezza massima Estremità adesive spontanee o costruite, fra loro uguali Estremità adesive complementari alle precedenti

La clonazione del DNA Clonazione non selettiva Genoma da saggiare frammentato con enzimi di restrizione P = 1 -(1 -f)N Individuazione dei geni clonati: Southern blotting Clonazione selettiva Cromosomi di l frammentati ligasi L’ibridazione cn la sonda radioattiva si effettua direttamente sui frammenti del genoma, identificando così il frammento da saggiare Genoteca di DNA ricombinante Clonazione Ibridazione su filtro con sonda radioattiva complementare al DNA da studiare 1) Si effettua l’elettroforesi su gel dei frammenti a doppia elica 2) Si denatura il DNA e lo si fa aderire a singolo filamento, nelle stesse posizioni, a un filtro 3) Si ibridizza con sonda radioattiva complementare al frammento cercato e si effettua l’autoradiografia, localizzando così il gene studiato

C-DNA, walking cromosomico e sequenziamento c. DNA WALKING CROMOSOMICO RNA Mediante piccole sonde, in comune a più frammenti è possibile mettere questi ultimi in sequenza Trascrittasi DNA polimerasi inversa AAAAA TTT primer IL c. DNA CONSENTE DI STUDIARE GLI m. RNA E CONFRONTARLI CON I GENI O I TRASCRITTI PRIMARI SEQUENZIAMENTO DEI NUCLEOTIDI 1) Si marca con 32 P l’estremità 5’ del frammento da analizzare, quindi si denatura il DNA 2) Si distruggono selettivamente basi o loro combinazioni (G, G+A, C, C+T), che rendono più fragile il filamento saggiato, che quindi si rompe in quei punti 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorsoin una corsa elettroforetica G G+A C C+T G C A T

Reazione a catena della polimerasi (PCR) PCR Taq polimerasi, resistente al caldo Primer 1 Regione complementare a Primer 2 Regione complementare a Si alternano cicli di denaturazione (a temperatura alta) e di replicazione ( a temperatura bassa), ciascuno dei quali porta un raddoppiamento del numero delle molecole

Costruire nuovi geni SINTESI DI SEQUENZE NON SU STAMPO: è possibile allungare filamenti di DNA al 5’ aggiungendo nucleotide dopo nucleotide costruendo oligonucleotidi di sequenza voluta INDUZIONE DI MUTAZIONI SPECIFICHE 1) Si rompe il DNA con endonucleasi 2) Si digeriscono singoli filamenti in direzione 5’ con esonucleasi 3) Si modificano specifici nucleotidi sul filamento rimasto; dopo la replicazione, anche il nuovo filamento sarà mutato nello stesso sito

Progressi nel sequenziamento Sequenziamento del DNA di singoli cromosomi Isolamento di singoli cromosomi con citometria a flusso 3) Singoli cromosomi contenuti in microgocce sono riconosciuti da sensori laser… 2) Colorazione con 2 fluorocromi, rispettivamente specifici per A-T e G-C, la cui emissione risultante è specifica per ciascun cromosoma 1) Raccolta di cromosomi in metafase con shock osmotico 4) Si effettua l’elettroforesi dei nuovi filamenti… Sequenziamento automatico del DNA primer 1) Si dispone di singoli filamenti di DNA con primer e DNA polimerasi AGGTTAC 3’ G TCCAAT T TCCAA 2) Si forniscono miscele di nucleotidi contenenti di-desossinucleotidi, privi di –OH al C 3’, che bloccano l’allungamento del nuovo filamento di DNA 4) …ricevono una carica elettrica specifica… 5) …e sono deviati da un campo elettrico nella “propria” provetta dd. A dd. G dd. T dd. C 3) Ciascun di-desossinucleotide è marcato con un fluorocromo specifico A TCC A TC C T 5’ TCCAATG 5’ 3’ 5) …e mediante spettroscopia automatica, si ottiene il profilo della sequenza

Dalla mappatura al sequenziamento del genoma Marcatori molecolari Sequenziamento “clone dopo clone” Alleli dei siti di restrizione (RFLP) 1) Mappatura di restrizione (“fingerprinting”) di una raccolta di grandi cloni da una genoteca, identificando le sovrapposizioni Sito di restrizione Trattamento con l’enzima di restrizione Allele non “tagliabile” Alleli per singole sostituzioni nucleotidiche (SNP) 2) Selezione del numero minimo di cloni sovrapposti 3) Frammentazione in sub-cloni dei grandi cloni superstiti e loro sequenziamento Alleli per numero di ripetizioni di mini- e microsatelliti (SSLP) Identificati per sequenziamento Sequenziamento “shotgun” 1) Frammentazione di genomi in genoteche di cloni di diversa grandezza Mappature di marcatori molecolari fra loro/con geni Mappe genetiche (ricombinazione) Mappe cromosomiche: ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) Mappe fisiche: sequenziamento del genoma 2) Sequenziamento di successivi campioni casuali di cloni di diversa grandezza e analisi automatizzata delle sequenze sovrapposte (“prova ed errore”)

Genomica strutturale Il sequenziamento del genoma utilizza le metodiche già descritte seguendo diverse fasi 1: compilazione – consiste nella ripetizione per numerose volte dell’intero processo per riempire le lacune e correggere gli errori dovuti alla natura empirica e casuale del processo Le lacune, oltre agli errori di metodo, sono dovute a regioni difficilmente sequenziabili: DNA satellite e geni ripetuti in tandem 2: annotazione – consiste nell’identificazione di presunti geni, riconoscibili come “open reading frames” (ORF), nel caso di codificazione di polipeptidi Le ORF iniziano con codoni di inizio traduzione (sul filamento trascritto 3’TAC 5’, su quello complementare 5’ATG 3’) e , dopo numerose triplette, terminano con codoni di stop. In un tratto di DNA sequenziato per la ricerca di ORF sono possibilli 3 tentativi di lettura, sfalsati di un nucleotide, per ciascuno dei due filamenti complementari. 3: verifica delle ORF – consiste nella ricerca in prossimità delle ORF di altre sequenze funzionali (promotori; negli eucarioti siti di splicing, di poliadenilazione etc. ). Oggi sono disponibili software sofisticati che minimizzano gli errori, tenendo conto di caratteristiche note del genoma (p. es. abbondanza di “isole Cp. G”- 5’CG 3’ in prossimità di geni) Solo il 5% del genoma umano consiste nei suoi circa 26. 000 geni; il 10% consiste in DNA satellite, il 50% in elementi trasponibili interspersi.

Genomica funzionale e proteomica Genomica funzionale 1) Una volta identificata una ORF come possibile gene, per verificare la funzione del polipeptide codificato si ricorre a banche dati di sequenze geniche note. Data l’estrema maggiore ricchezza del repertorio proteico (proteoma) di un organismo rispetto al genoma, è utile indagare il proteoma nel suo complesso. Si effettua un’elettroforesi bidimensionale del proteoma espresso in determinate condizioni ambientali di una popolazione cellulare. 2) Si effettua un confronto dettagliato con i geni simili trovati. 3) Si analizzano i ”motivi” funzionali dei polipeptidi codificati, con l’ausilio di banche dati di catene polipeptidiche. Ancora oggi per moltissime ORF dei genomi finora sequenziati non è stata definita una funzione. Microarray a DNA Su una lastra sono collocati 104 -105 pozzetti, ciascuno con un oligonucleotide a singolo filamento di DNA. Si possono ottenere 102 -104 diverse macchie. Una volta isolata una proteina nel proteoma, prelevandola dal gel, la si tenta di identificare con una digestione parziale e il confronto con banche dati di catene polipeptidiche e loro frammenti. Gli oligonucleotidi di ciascuna riguardano lo stesso gene, con l’allele normale e diverse mutazioni. Il/i gene/i da saggiare è amplificato per PCR, coniugato con fluorocromi e collocati sul microarray. Solo sequenze complementari si legheranno ai pozzetti, rivelando eventuali mutazioni.

Genetica diretta e genetica inversa Genetica diretta Genetica inversa 1) Si inducono mutazioni casuali (con radiazioni, sostanze chimiche, elementi trasponibili). 1) Si isola e si sequenzia una proteina la cui funzione deve essere indagata). 2) Si effettua uno screening genetico, attrverso test specifici, per riconoscere i mutanti. 2) Si determinano le possibili sequenze di c. DNA, costruendo un corredo di oligonucleotidi. 3) Si assegnano i nuovi mutanti ai propri gruppi di complementazione, identificando il gene mutato. 3) Si saggiano gli oligonucleotidi con i cloni di una ganoteca, identificando il gene putativo. 4) Si analizza il ruolo dell’eventuale nuovo gene nella rete di interazioni fra geni (epistasi, soppressione etc. ). 4) Si confronta la sequenza polipeptidica codificata dal gene putativo con sequenze presenti in banche dati, cercandone i motivi funzionali. 5) Si mappa il gene, prima costruendo una mappa genetica, quindi una mappa fisica. 5) Si costriscono mutanti “knock out” (con perdita di funzione, spesso delezioni intrageniche) o con sostituzione genica, mediante mutagenesi sito-specifica e se ne studiano gli effetti fenotipici. 6) Si clona e si sequenzia il gene. 6) Si possono usare gli si. RNA per inattivare i geni bersaglio, al posto dei mutanti knock out (silenziamento epigenetico