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http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Aplicaciones de la técnica SAXS Small Angle X-ray Scattering

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) I q

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) DIFERENCIAS ENTRE SAXS Y DIFRACCIÓN RX NO necesitamos sistemas sólidos formación de nanopartículas DIAGNOSIS DE CANCER DE MAMA No necesitamos Cristalizar Cristales líquidos Polimeros, Micelas Partículas, Nanopartículas Diagnóstico de Cancer Posibilidad de determinar la estructura de macromoléculas biológicas pero en su medio natural Medidas Dinámicas

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Procedimiento Experimental Sustracción deldiferentes blanco recogidas Promediado de las Solvente Muestra Solvente Técnica de contraste

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN SISTEMAS MONODISPERSOS Un aumento de la concentración inplica una disminución I a bajos ángulos Sistemasde nolainteraccionantes debido a las interacciones entre partículas I/c q q

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) ESPACIO RECIPROCO – ESPACIO REAL Función de Scattering La Curva de Scattering muestra la información del espacio recíproco Función de distribución de pares La Pr muestra la información del espacio Real

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) FACTOR DE FORMA PARTÍCULAS CILÍNDRICAS PARTÍCULAS ESFÉRICAS PARTÍCULAS DE MÚLTIPLES UNIDADES Persentan múltiples máximos Presentan máximo a en función un de las distancias menores un distancias intra_subunidades y entre Presentan máximo a correspondientes unidadesal radio Dmax/2 de la sección transversal

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) ¿PORQUÉ SAXS PARA MACROMOLÉCULAS? • Posibilidad de obtener parámetros moleculares de forma sencilla: 1 - Radio de Giro 2 - Peso Molecular 3 - Volumen 4 - Grado de Hidratación Datos a Baja Resolución 5 - Forma • Posibilidad de construir modelos atómicos de la estructura Datos a Alta Resolución + ayuda otras técnicas

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) INFORMACIÓN ESTRUCTURAL EN MOLÉCULAS BIOLÓGICAS ESTRUCTURA SECUNDARIA Estructura β Helice α Grigoryev en 1971 encontró tanto en polipéptidos sintéticos como en naturales que se puede determinar de forma sencilla si se trata de una estructura β o de una hélice α puesto que ambas presentan un máximo característico en las curvas de SAXS.

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) METODOS ab initio Métodos de Ensayo-Error • • Es de genera gran utilizar para localizar fragmentos molécula Metodología comoesfera anterior con “Residuos” • Se una depero diámetro Dmaxde laconocidos que no • Se se han podido determinar por otras técnicas puede acotar las soluciones • Se trata de conocer las coordenadas de estosmodelo residuos • Históricamente el primer • Se rellena de “bolas” defue radio r 0 laun curva • Se • que fijaajusten lo conocido y seexperimental lanzade el proceso de annealing Simulando proceso annealing donde se • Número pequeño de parámetros • Genera unfactor código binario: para minimizar las diferencias • Cambian criterios de incluye un decompacidad penalización que asegure • Datos baja resolución por criterios de distribución espacial una forma compacta y conectada 1 si pertenece a la partícula • Determina formas con huecos en suelinterior • Se limitaba a definir contorno de la 0 si pertenece al solvente molécula con formas geométricas Svergun, D. I. , Petoukhov, M. V. & Koch, M. H. J. (2001) sencillas • Mediante un método Monte-Carlo (aleatorio) Biophys. J. 80, 2946 -2953. se modifica en código para generar las curvas Chacón, P. et al. Chem. (1998)Biophys. Stuhrmann, H. B. (1970) Z. Physik. N. F. J. 74, 2760 D. I. (1999)Biophys. J. 76, 2879 72, 177 Svergun, D. I. et Svergun, al. (1996)Acta Crystallogr. A 52, 419

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) MODELOS ATÓMICOS La estructura própia de la proteina (PDB) Si tenemos información adicional sobre la estructura y buenos datosentera experimentales podemos de de las misma Si no la conocemos podemos mediante losevaluar fragnemtos precisa modelo estructural refinarforma mediante sólidonuestro rígido rotaciones y traslaciones de los mismos para generar la estructura completa Volumen del solvente excluido de la partícula Pero aún así la situación no es fácil puesto que debemos de tener en cuenta: Capa de Hidratación

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Refinement of Multidomain Protein Structures by Combinationof Solution Small-Angle X-ray Scattering and NMR Data Alexander Grishaev, *, † Justin Wu, ‡ Jill Trewhella, § and Ad Bax*, † Contribution from the Laboratory of Chemical Physics, NIDDK, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892 -0520, Department of Biochemistry, The Ohio State Uni. Versity, Columbus, Ohio 43210, and Department of Chemistry, Uni. Versity of Utah, Salt Lake City, Utah 84112 -0850 Received June 30, 2005; E-mail: grishaev@speck. niddk. nih. gov; bax@nih. gov Abstract: Determination of the 3 D structures of multidomain proteins by solution NMR methods presentsa number of unique challenges related to their larger molecular size and the usual scarcity of constraintsat the interdomain interface, often resulting in a decrease in structural accuracy. In this respect, experimentalinformation from small-angle scattering of X-ray radiation in solution (SAXS) presents a suitable complementto the NMR data, as it provides an independent constraint on the overall molecular shape. A computationalprocedure is described that allows incorporation of such SAXS data into the mainstream high-resolutionmacromolecular structure refinement. The method is illustrated for a twodomain 177 -amino-acid protein, çS crystallin, using an experimental SAXS data set fitted at resolutions from 200 Å to 30 Å. Inclusionof these data during structure refinement decreases the backbone coordinate root-mean-square differencebetween the derived model and the highresolution crystal structure of a 54% homologous çB crystallinfrom 1. 96 ( 0. 07 Å to 1. 31 ( 0. 04 Å. Combining SAXS data with NMR restraints can be accomplished ata moderate computational expense and is expected to become useful for multidomain proteins, multimericassemblies, and tight macromolecular complexes. DRX

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) Addition of Missing Loops and Domains to Protein Models by X-Ray Solution Scattering Maxim V. Petoukhov, *† Nigel A. J. Eady, ‡ Katherine A. Brown, ‡ and Dmitri I. Svergun*§ *European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation, D-22603 Hamburg, Germany; †Physics Department, Moscow State University, 117234 Moscow, Russia; ‡Department of Biological Sciences, Centre for Molecular Microbiology and Infection, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London SW 7 2 AY, United Kingdom; and §Institute of Crystallography, Russian Academy of Sciences, 117333 Moscow, Russia ABSTRACT Inherent flexibility and conformational heterogeneity in proteins can often result in the absence of loops andeven entire domains in structures determined by x-ray crystallographic or NMR methods. X-ray solution scattering offers thepossibility of obtaining complementary information regarding the structures of these disordered protein regions. Methods arepresented for adding missing loops or domains by fixing a known structure and building the unknown regions to fit theexperimental scattering data obtained from the entire particle. Simulated annealing was used to minimize a scoring functioncontaining the discrepancy between the experimental and calculated patterns and the relevant penalty terms. In lowresolutionmodels where interface location between known and unknown parts is not available, a gas of dummy residuesrepresents the missing domain. In high-resolution models where the interface is known, loops or domains are represented asinterconnected chains (or ensembles of residues with spring forces between the C atoms), attached to known position(s) inthe available structure. Native-like folds of missing fragments can be obtained by imposing residue-specific constraints. Aftervalidation in simulated examples, the methods have been applied to add missing loops or domains to several proteins wherepartial structures were available.

http: //imaisd. usc. es/riaidt/raiosx/ Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de Raios. X ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering) SINCROTÓN LNLS (Campinas, Brasil)