UNIVERSIDADE DE VORA TODAS AS VIAS VO DAR

UNIVERSIDADE DE ÉVORA TODAS AS VIAS VÃO DAR AO PROTEASSOMA … OU QUASE TODAS! Docente: Prof. Paulo de Oliveira Discentes: • Ana Filipa Robalo 30703 • Ana Rita Hipólito 30237 23 de Junho de 2014 Biologia do Desenvolvimento 2013 -2014

A UBIQUITINAÇÃO A ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos; A ubiquitina contem 7 lisinas, que podem ligar-se a outras ubiquitinas para formar uma cadeia de poliubiquitinas; DEGRADAÇÃO PROTEICA A ubiquitinação é uma modificação pós-traducional dinâmica e reversível; Está implicada em inúmeros processos celulares; É realizada por ubiquitinas formando complexos (E 1, E 2, E 3); REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃ O É revertida por DUBs (Deubiquitination Enzymes); RESPOSTA AO STRESS UBIQUITINA SINALIZAÇÃO DA ENDOCITOSE REGULAÇÃO DO CICLO CELULAR CIRCULAÇÃO DE PROTEÍNAS Fig. 1 – Tipos de Ubiquitinação (2)

LIGAÇÃO UBIQUITINA-PROTEÍNA " O sistema ubiquitina-proteassoma funciona, normalmente, no controlo de degradação de proteínas Ligação da Ub com a enzima ativadora de Ub (E 1) A Ub ativada é transferida para uma enzima conjugadora de Ub (E 2) Há a ligação à proteína e transferência da Ub para a proteína A E 2 transfere a Ub para uma enzima ubiquitina ligase (E 3) Fig. 2 – Mecanismo de ligação ubiquitina-proteína e condução ao proteassoma (2) A proteína ubiquitinada é reconhecida pelo proteassoma e degradada As DUBs são capazes de remover a ubiquitina antes da proteína-alvo entrar no proteassoma Ub: Ubiquitina E 1: Enzima-ativador-ubiquitina E 2: Enzima-conjugação-ubiquitina E 3: Proteína-ligase-ubiquitina DUBs: Enzima desubiquitinadora Substrate: Proteína-alvo

UBIQUITINAÇÃO E A VIA NF-KB NF-k. B é um fator de transcrição Fatores de transcrição da família do NF-k. B são reguladores de muitos processos incluindo imunidade, inflamação e apoptose Da família do NF-k. B fazem parte: Rel-A (p 65), c-Rel, Rel-B, p 50 e p 52 A ubiquitina está envolvida em pelo menos 3 passos nesta via A ativação da via NF-k. B é classificada como canónica e não canónica, dependendo se a ativação envolve a degradação de Ik. B ou processamento de p 100

VIA CANÓNICA Estimulação celular com IL-1β ou TNFα Poliubiquitinação de Ik. B e degradação pelo proteassoma Ativação de TAK fosforila e ativa IKK DUBs IKKβ fosforila proteínas Ik. B Ativação do complexo IKK Libertação de NFk. B Fig. 3 – Via canónica do NF-k. B (8)

UBIQUITINAÇÃO E DEGRADAÇÃO DO IKB É levada a cabo por uma E 2 da família Ubc 4/5 e pela ligase E 3 SCF-βTr. CP. Proteínas βTr. CP ligam-se especificamente à forma fosforilada de Ik. B. O Ik. B poliubiquitinado permanece associado com NFk. B, mas é seletivamente degradado pelo proteassoma pois o NF-k. B é poupado. A via da ubiquitinaproteassoma é também responsável pelo processamento de p 105 e p 100 para p 50 e p 52 respetivamente.

VIA NÃO-CANÓNICA Estimulação por BAFF Ativação da proteína quinase NIK por sua vez ativa IKKα Degradação dos domínios Ik. B e maturação É poliubiquitinado e segue para o proteassoma IKKα fosforila p 100 O p 52 e o Rel-B translocam-se para o núcleo Regulação da expressão génica Fig. 4 – Via nãocanónica do NF-k. B (8)

MODELO DE PROCESSAMENTO DO P 100 NO PROTEASSOMA A via da ubiquitina-proteassoma é responsável pelo processamento de p 105 e p 100 para p 50 e p 52 respetivamente. ? Como é que o proteassoma degrada parcialmente a proteína? Mais especificamente, o que define onde é que a degradação começa e acaba Fig. 5 – Porção da via canónica do NF-k. B (8)

MODELO DE PROCESSAMENTO DO P 100 NO PROTEASSOMA Foi recentemente proposto um modelo plausível O p 100 é recrutado para o proteassoma permitindo que a região GRR se insira no proteassoma como um loop Degradação do polipéptido dá-se em ambas as direções dos terminais N e C A degradação do terminal C prossegue até ao fim A degradação do terminal N é interrompida quando se encontra com a estrutura RHD A subunidade p 52 resultante e seu parceiro Rel-B são então libertados do proteassoma Fig. 6 – Modelo de processamento do p 100 no proteassoma (8)

β UBIQUITINAÇÃO E A VIA TGF Um dos mais importantes reguladores da comunicação celular em todos os organismos multicelulares. Induz a expressão de vários genes É uma citocina envolvida na regulação da proliferação celular, diferenciação, apoptose e migração de diversos tipos celulares. A sinalização anormal pelo TGF-β resulta no desenvolvimento de tumores, e está relacionada com vários tipos de cancro no homem É indispensável a existência de regulação desta sinalização – Recetores, Smads e outros reguladores de sinal

β UBIQUITINAÇÃO E A VIA DO TGFRegulação da sinalização por Smads - Smurfs Smurf 1 Ubiquitinaçã o Smad 5 Smad 1 Smurf 2 Smad 2 Ubiquitinaçã o E 3 Ub ligase U-box Controlo da sensibilidade da célula ao TGF β por ajustamento da abundância relativa e absoluta dos diferentes Smads antes da iniciação da sinalização. Smad 3 Complexo Axina/GSK 3 β Para limitar a sinalização por Smad, dá-se a fosforilação dos R-Smads, que aumenta a suscetibilidade à ubiquitinação.

β UBIQUITINAÇÃO E A VIA DO TGFRegulação negativa da sinalização por TGF-β Recetores GF β T ção Ubiqu tina itinaç qui + Ubi WWP 1 CD 109 ão Recruta ISmads Recruta Smurfs NEDD 4 -2 Núcleo

β UBIQUITINAÇÃO E A VIA DO TGF- Regulação positiva da sinalização por TGF-β GF β Ubiquitinaçã o T Arkadia Reguladore s negativos da sinalização por TGF- β Smad 7 Arkadia Axi na Smurf 2 Wnt APC c-Ski Sno. N Arkadia RB 1 1 CC Smurf 2 APC Co-activador transcripcional Interacção Smads Núcleo

UBIQUITINAÇÃO E A VIA DO WNT A sinalização por Wnt medeia processos de desenvolvimento e homeostase incluindo manutenção das stem cells, crescimento e especificação do destino das células, polaridade celular e migração. A ativação imprópria da sinalização por Wnt está relacionada com uma vasto conjunto de doenças humanas como cancro e doenças neurodegenerativas. Na cascata Wnt/β-catenina, os eventos de sinalização convergem na regulação da degradação mediada por ubiquitinação do fator transcricional β-catenina.

UBIQUITINAÇÃO E A VIA DO WNT Sinalização por Wnt Ausência de sinalização por Wnt Fz Complexo Axina/APC CK 1 Wnt Lrp 5/6 GSKβ Dvl P P P βcatenina Sistema Ubiquitina Proteassoma Fosfo - β -catenina Inativação da transcrição do gene alvo Complexo Axina/APC βcatenina β-CATENINA/TCF Ativação da transcrição do gene alvo Núcleo

UBIQUITINAÇÃO E A VIA DO WNT Várias ubiquitinas ligases marcam a β-catenina para degradação no proteassoma: β-Tr. CP • Reconhece a β-catenina fosforilada e marca-a para degradação Siah-1 • Induzida pelo stress genotóxico – p 53 • Pode agir em conjunto com a E 2 Ubc. H 5 a 53 Jade-1 • Interage diretamente com a β-catenina fosforilada • Age em conjunto com a E 2 Ubc. H 6 ou Ubc. H 2 • Age por um mecanismo dependente de VHL

CHECKPOINTS DO CICLO CELULAR – TRANSIÇÃO G 1/S A progressão do ciclo celular é controlada pela regulação complexos CDK-ciclina. dos Estão envolvidas várias ciclinas - a sua atividade conjunta contribui para a progressão do ciclo. Na ausência de estímulo mitogénico, as células podem entrar em G 0. Fig. 7 – Checkpoints do ciclo celular (13)

CHECKPOINTS DO CICLO CELULAR – TRANSIÇÃO G 1/S CDK 2/Ciclina E Ubiquitinação Instável: Síntese VS Proteólise Quando existe estímulo, as Ciclinas D acumulam-se na célula: CDK 4/6 / Ciclina D Fos fo do R rilação da f b a Fos foril mília açã o do de p p 27 SCDSkp 2 ubiquitina ligase rote ínas Progressão do ciclo celular Monomérica: Cul-3 Ciclina A Complexo: SCDSkp 2 ubiquitina ligase Ciclina E

CHECKPOINTS DO CICLO CELULAR – TRANSIÇÃO G 1/S Células cancerosas PC-3 Inativa HOXB 13 Factor de transcrição que se pensa atuar como supressor de tumores por provocar a paragem do ciclo celular em células cancerosas PC-3, o que significa que é essencial para o checkpoint. CDK 4/6 Ciclina D G 1 Progressão do ciclo celular

CHECKPOINTS DO CICLO CELULAR – TRANSIÇÃO G 2/M Checkpoint Spindle-assembly • Fator de resposta ao stress HOXB 13 • Sofre fosforilação por cinases Ubiquitinação CDK 1/Ciclina B Entrada oportuna em M Progressão do ciclo celular

CHECKPOINTS DO CICLO CELULAR – SPINDLE-ASSEMBLY Assegura que a anafase não começa até os pares de cromatídeos estarem corretamente alinhados e o fuso formado. Funciona através do controlo da atividade do complexo promotor de anafase (APC), responsável por iniciar a separação dos cromossomas na anafase. Detecta a existência de cinetocoros livres e inibe a atividade do APC. É um ciclo continuo de ubiquitinações e desubiquitinações que tende sempre para esta última, garantindo assim que o APC é mantido inativo até o fuso estar completamente formado. Fig. 8 – Checkpoint - Spindle-assembly (3)

REGULAÇÃO DA APOPTOSE PELA UBIQUITINA A apoptose é um processo de morte celular programada altamente regulado Essencial para o desenvolvimento normal da célula Essencial para a homeostasia dos tecidos Usada como estratégia de defesa contra infeções virais Envolvida na autoimunidade Envolvida na emergência cancerígena

REGULAÇÃO DA APOPTOSE PELA UBIQUITINA Ativação da caspase 9 Via Intrínseca (mitocondrial) Regulada pela família de proteínas Bcl-2, a proteína adaptadora apoptótica fator-1 (Apaf-1) de ativação de proteases, e as caspases. APOPTOSE Via Extrínseca (citoplasmática) Desencadeada através da ligação ligandorecetor que iniciam a montagem de plataformas de ativação da caspase-8.

REGULAÇÃO DA APOPTOSE PELA UBIQUITINA Membros da família Bcl-2 incluem: Proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-x. L, Bcl-w e Mcl-1 Proteínas proapoptóticas Bax, Bak, Bad, Bid e Bim Níveis regulados por ubiquitinação

REGULAÇÃO DA APOPTOSE PELA UBIQUITINA " Ubiquitinas ligases E 3 têm emergido como sendo a chave reguladora do programa de apoptose. " As mais proeminentes ligases E 3 implicadas na modulação direta da apoptose são as proteínas IAP: " XIAP " c. IAP " BRUCE " MDM 2 A atividade de IAPs pode ser suprimida por fatores pro-apoptóticos, como as Smac. Alguns IAPs promovem a ubiquitinação e degradação de Fig. 9 – Ubiquitinação na apoptose (7)

UBIQUITINAÇÃO DE HISTONAS " As histonas podem ser modificadas através da ubiquitinação; " A histona H 2 A foi a primeira proteína a ser identificada ubiquitinada; " A maioria da u. H 2 A está na forma monoubiquitinada, a H 2 A poliubiquitinadas também tem sido detetada em muitos tecidos e tipos de células; " A histona H 2 B também é ubiquitinada; " Devido ao facto de a transcrição ocorrer no contexto de nucleossomas, o efeito da ubiquitinação de histonas na transcrição tem sido investigado. Fig. 10 – Estrutura do nucleossoma in http: //www. fomosplanejados. com. br/capitulos/assunto. asp? codcapitulo=22&codassunto=101&n

NUCLEOSSOMAS E UBIQUITINAÇÃO DE HISTONAS Enzimas envolvidas na ubiquitinação de histonas A adição de uma porção de ubiquitina a uma proteína envolve a ação sequencial das enzimas E 1, E 2 e E 3 Estudos in vitro usando proteínas de levedura Rad 6 e Cdc 34 mostraram ser capazes de ubiquitinar H 2 B sem presença de E 3. Estudos mais recente sugerem que Rad 6 (E 2) associado com a proteína Bre 1 (E 3) está envolvido na ubiquitinação de H 2 B. As enzimas E 2 e E 3 envolvidas na ubiquitinação de H 2 A ainda não foram identificadas. Contudo, estudos in vitro mostraram que Rad 6 purificada pode ubiquitinar H 2 A e H 2 B, embora isso não seja totalmente claro.

NUCLEOSSOMAS E UBIQUITINAÇÃO DE HISTONAS Mecanismo da regulação da transcrição pela ubiquitinação e desubiquitinação de histonas Existem pelo menos três possíveis explicações de como a ubiquitinação de histonas afeta a transcrição: A ubiquitinação de histonas pode afetar o maior nível de enrolamento da cromatina, resultando assim num maior acesso do DNA à maquinaria de transcrição A ubiquitinação pode funcionar como sinal para o recrutamento de moléculas regulatórias que, por sua vez, afetam a transcrição AS A ubiquitinação de histonas afeta a transcrição através do seu impacto sobre outras modificações de histonas (acetilação e metilação) F O DÇÕE C O GA I EST S V N I

CONCLUSÃO A ubiquitinação é um processo pós-traducional que desempenha importantes funções ao nível da sinalização celular, da regulação da transcrição, da regulação do ciclo celular, da reparação do DNA e do “controlo de qualidade” das proteínas, através da sua marcação para degradação no proteassoma. É um mediador ideal para o crosstalking entre diferentes vias. As E 3 ligases mostram especificidade para certos alvos, no entanto, a sua ação in vivo depende de outras proteínas que atuam como adaptadores ou ativadores da sua atividade. Deficiências neste processo podem levar ao desenvolvimento de cancro e a outras alterações fisiológicas.

REFERÊNCIAS 1. ABERLE, Hermann et al (1997) “β-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway”, The EMBO Journal 2. BERRIDJE, Michael J. (2012 a) Cell Signalling Biology: Module 1 – “Introduction”, Biochemical Journal, 1 3. BERRIDJE, Michael J. (2012 d) Cell Signalling Biology: Module 9 – “Cell Cycle and Proliferation” , Biochemical Journal, 1 4. BOECK, Miriam D. ; DIJKE, Peter T. (2012) “Key role for ubiquitin protein modification in TGF-β signal transduction”, Journal of Medical Sciences 5. BROEMER, Meike; MEIER, Pascal (2009) “Ubiquitin-mediated regulation of apoptosis”, Trends in Cell Biology, 6. CHEN, Jueqi; CHEN, Zhijian J. (2013) “Regulation of NF-k. B by Ubiquitination”, Curr Opin Immunol 7. CHEN, Yu-Shan; QIU, Xiao-Bo (2013) “Ubiquitin at the crossroad of death and survival”, Chinese Journal of Cancer 8. CHEN, Zhijian J. (2005) “Ubiquitin Signlaling in the NF-k. B Pathway”, Nat Cell Biol, 9. HAMID, Sayed M. , et al (2014) “HOXB 13 contributes to G 1/S and G 2/M checkpoint controls in prostate”, Molecular and Cellular Endocrinology 10. HATAKEYAMA, Shigetsugu (2012) “Ubiquitin-mediated regulation of JAK-STAT signaling in embryonic stem cells”, Landes Bioscience 11. LI, Vivian et al (2012) “Wnt Signalling through Inhibition of β-Catenin Degradation in na Intact Axin 1 Complex” 12. NAPETSCHNIG, Johanna; WU, Hao (2013) “Molecular Basis of NF-k. B Signaling”, Annu Ver Biophys, 13. SCHNERCH, Dominik et al (2012) “Cell cycle control in acute myeloid leukemia”, American Journal of Cancer Research 14. SOOND, Surinder M. ; CHANTRY, Andrew (2011) “How ubiquitination regulates the TGF- β signalling pathway: New insights and new players”, Prospects & Overviews 15. TAURIELLO, Daniele; MAURICE, Madelon (2010) “The various roles of ubiquitin in Wnt pathway regulation”, Landes Bioscience 16. WE, Juncheng et al (2012) “The Ubiquitin Ligase TRAF 6 Negatively Regulates the JAK-STAT signaling Pathway by Binding to STAT 3 and Mediating its Ubiquitination”, 17. WU, Zhao-Hui; SHI, Yuling (2013) “When Ubiquitin Meets NF-k. B: A trove for anti-cancer drug development”, Curr Pharm Des, 18. ZHANG, Yi (2003) “Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination”, Genes & Development 19. ZHANG, Ying, et al (2001) “Regulation of Smad degradation and activity by Smurf 2, an E 3 ubiquitin ligase”

OBRIGADA PELA ATENÇÃO! Proteassoma Proteína Péptidos Docente: Prof. Paulo de Oliveira Discentes: • Ana Filipa Robalo 30703 • Ana Rita Hipólito 30237