PRIONLAR KROMOZOMAL POZSYON ETKS Do Dr Sercan ERGN

• + PRIONLAR, KROMOZOMAL POZİSYON ETKİSİ Doç. Dr. Sercan ERGÜN Tıbbi Biyoloji ABD

• + PRIONLAR Doç. Dr. Sercan ERGÜN Tıbbi Biyoloji ABD

TARİHÇE 3

1730 lar İlk Scrapie olguları 1982 Bu bir protein!! 1950 ler Kuru salgını 1960 lar Bulaşıcılık! 1980 ler Tıbbi Felaket!! 1985 Genlerimizde bulunuyor!! 1986 SALGIN!!! Deli dana hastalığı 1996 http: //learn. genetics. utah. edu Deli danalı etin insan için önemi 4

PRION HASTALIKLARI Yavaş virus enfeksiyonları Transmissible Spongiform Encepholopathies (TSE) İnsan ve hayvanda Merkezi Sinir Sistemi’nin etkilendiği bir hastalık grubudur Sporadik Familial Kazanılmış 5

PRION HASTALIKLARI (Transmissible Spongiform Encepholopathies) Sporadik Familial Kazanılmış Sporadik Creutzfeldt-Jacob Disease (s. CJD) Sporadik Familial Insomnia (s. FI) Familial Creutzfeldt-Jacob Disease (f. CJD) Fatal Familial Insomnia (f. FI) Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome (GSS) İyatrojenik Creutzfeldt-Jacob Disease (i. CJD) Varyant Creutzfeldt-Jacob Disease (v. CJD) Kuru 6

KURU Papua Yeni Gine - Fore halkında bazı ailelerde 1900 başlarında ortaya çıkan 1957 -1968 arasında 1, 100 ölüm Ölenlerin çoğunluğu Kadın Çocuk Yaşlılar İnkübasyon süresi çok uzun 7

KURU Virolog Carleton Gajdusek (1957) Çevresel, etken ve toksin ? ? ? Genetik bir hastalık? ? ? Veteriner Dr. William Hadlow (1959) C Gajdusek Koyunların scrapie hastalığı ile benzerlik!! Kuru’nun şempanzelere aktarımı ile ilgili deneysel çalışmalar CJD ile benzerliğinin fark edilmesi Nobel ödülü 1976 8

KURU Kas güçsüzlüğü Koordinasyon kaybı Gülme krizleri İmmün yanıt gelişmemesi Beyin dokusunda hasar 9

KURU Kanibalizm ve cenaze ritüellerine bağlı olarak gelişir Ölen yakınlarının kas dokusu erkekler, beyin ise kadın ve çocuklar tarafından yenir Son enfekte olan kişiler 50 -60 yaşlarındadır 10

FATAL FAMILIAL INSOMNIA (İNSAN) o. Pr. P GEN MUTASYONU o 36 -60 YAŞ ARASINDA o. UYKU BOZUKLUĞU o. KOMA oÖLÜM CREUTZFELDT-JACOB HASTALIĞI SCRAPIE BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY (BSE) CHRONIC WASTING DISEASE KURU 11

YAVAŞ VİRUS ENFEKSİYONLARI Uzun inkübasyon dönemi Çok uzun süre semptom olmaması Genellikle yavaş ilerleyen lethal hastalıklar 12

CANLILAR EUKARYOTE HAYVAN NONSELLÜLER PROKARYOTE VİRUS PRİON EUBACTERIA BİTKİ ARCHAEOBACTERIA FUNGUS PROTOZOA 13

MİKROORGANİZMALAR NONSELLÜLER ÖKARYOT PROKARYOT FUNGUS PROTOZOA ÖBAKTERİ VİRUS PRİON ARKEBAKTERİ 14

PRİON Enfeksiyöz ajanlar; çoğalabilmek, nesillerini sürdürebilmek için DNA ve/veya RNA içerir Prionlar; protein yapısındadır ve DNA ve/veya RNA içermediği halde hücre içinde çoğalabilir O halde genom yapılarının özelliği nedir? ? ? Dr. Stanley B. Prusiner Scientific American 1984; 251: 48 -57 1997 Nobel Fizyoloji-Tıp 15

PRION Small proteinaceous infectious particles Nükleik asitleri inaktive eden yöntemlerden etkilenmez spongiform encephalopathies olarak anılmasının nedeni beyin korteksi ve serebellumda geniş vakuoller oluşturmasıdır 16

PRİON Genetik insanda belirlendi Bulaşıcılık Scrapie hayvan modelleri hipofiz kaynaklı hormon İngiltere’de koyunlarda BSE 17

PRİON Nükleik asit içermez Büyüklüğü 15 -40 nm. Hidrofobik yapıda oldukları için kolay agrege olurlar, bu nedenle büyüklük ve dansite yönünden farklılık gösterirler Nukleazlar, UV gibi mikroorganizmalara etkin olan yöntemlerden etkilenmezler Proteinaz K, tripsin gibi maddelerin yüksek dozları etkilidir 18

PRİON Normal kişilerde bulunan Pr. Pc proteininin anormal bir izoformu Pr. Psc 27 -30 k. Da protein enfektiviteden sorumlu protein Hasta kişilerin beyin dokularında hastalığın evresi ile orantılı miktarda saptanır Prusiner (1980’ler) 19

PRION PROTEİNLERİNİN AGREGE OLACAK FORMA DÖNÜŞÜMÜ Pr. PC – Pr. P hücresel izoformu Pr. PSc Pr. PSC – scrapie benzer izoformu 20

Prion Proteinleri (Pr. Psens Pr. Pres ) a b • Pr. Psens - Pr. Pc • Pr. Pres – Pr. Psc - Pr. PTSE • Proteinase K sensitive • Proteinase K resistant • Deterjanda erir • Deterjanda agrege olur 21

PRİON Pr. Pc proteini beyin dokusunda diğer dokulara oranla 50 kat daha fazla bulunur Bu durum TSE olgularının patogenezinde neden MSS tutulduğunu açıklamaktadır Pr. Psc beyin dokusundan ayrıştırmak güçtür 22

Pr. Pc Pr. Psc Pr. Pc hücre membranında yarı ömrü 5 saat kadardır Glikozil fosfatidil inozitol (GPI) aracılığı ile hücre içine girer Endolizozom içine alınır Pr. Psc dönüşümü muhtemelen hücre içine alım sırasında olmaktadır Pr. Psc sadece sitoplazmada toplu olarak saptanmaktadır 23

GPI 24

PRİON HİPOTEZİ Pr. P, pr. P-res’e bağlayan bir liganttır Pr. P-res Pr. P-c Pr. P substrattır Pr. P-res Pr. P-c ve pr. P-res kompleks oluşturur x Protein X bir şaperon olarak Pr. P-c - pr. P-res 25 değişimi

Pr. PC Pr. PSC X-şaperon NMR GÖRÜNTÜLERİ 26

27

28

Pr. P geni (PRNP) 20 kromozom kısa kolu üzerinde yer alır İnsan Pr. P proteini 253 AA oluşur N terminalinde 2 hexapepetit ve tekrarlayan oktapepdit yer alır C terminali Glikozil fosfatidil inozitol (GPI) ile ilişkilidir 29

PRİON Viruslarda konak özgüllüğü vardır Prionlar ise, bulaştıkları türün özelliğini kazanır İlk bulundukları türe ait özelliği kaybeder İnsan Prionu Fare prionu 30

31

PATOGENEZ - İMMÜN SİSTEM Dendritik hücreler ve makrofajlar bu ajanların organizmada çoğaldığı ilk hücrelerdir Lenfoid dokularda folliküler dendritik hücrelerde (FDCs) çoğalır ve bu dokuda bulunan sinir hücrelerine invazyon yaparlar 32

TSE ajanının oral yolla alınması perifer sinir dokusu Merkezi sinir sistemi lenfatik sistem kan beyin ve spinal kord 33

İNSANDA v. CJD Pr. PTSE histokimyasal olarak gösterildiği dokular Üst mezenterik ganglion Sempatik celiak ganglion Dorsal root Trigeminal ganglion Barsak ganglionları Parasempatik ganglion Tonsiller Apendiks YAZARLAR BU BULGULARIN DİKKATLE DEĞERLENDİRİLMESİ GEREKTİĞİNİ VURGULUYORLAR Beekes M, Mc. Bride P. 34 FEBSJournal 2007, 274: 588

PATOGENEZ İnkübasyon süresi; doğal veya deneysel TSE olgularında, klinik semptom olmadan oldukça uzundur Kuru hastalığı ve büyüme hormonuna bağlı gelişen olgularda 40 yıla kadar uzayabilir Hastalık başladıktan sonra remisyon olmadan yavaş olarak ilerler BOS ve kanda enflamasyon bulgusu yoktur Beyin dokusunda herhangi bir enfeksiyöz ajan saptanmaz 35

PATOGENEZ Enfekte kişilerin organ ekstraklarının ultrafiltratlarının enjeksiyonu ile deneysel olarak bulaş sağlanabilir Genetik yapıya da bağlı olarak, enfektivite; Etken Miktar Veriliş yolu ile ilişkilidir İntraserebral enjeksiyon Oral yol 1 ünit 125. 000 ünit 36

PATOGENEZ Etkenin doğal yollarla bulaşı halinde; özellikle BSE ajanı, oral yolda dahil olmak üzere daha fazla enfeksiyözdür Türler arasında bulaş olabilmesi için, alıcı ve verici Pr. P genlerinin homolog olması gerekir HLA genlerinin de etkisi olmakla beraber, daha azdır 37

PATOGENEZ İnsanda 129. kodonda Pr. P gen polimorfizmi vardır, Valin veya methionin kodlanabilir Genel populasyonun %50 si homozigottur Sporadik ve iyatrojenik CJD olgularında homozigotluk duyarlılığı arttırmaktadır v. CJD olgularının hepsinde methionin/methionin homozigotluğu saptanmıştır 38

PATOGENEZ Pr. Pc Pr. Psc dönüşümü Pr. Psc toplanmasına bağlı sinir ölümü Pr. Psc ekstrasellüler bölgeye geçmesi Astrositlerin aktivasyonu Mikroglia aktivasyonu Gliozis Nöron ölümü apoptoz 39

PATOGENEZ Pr. Pc, Pr. Psc ile direkt temastan sonra transforme olur Pr. Psc proteolizise dirençli olduğu için enfekte hücre sitoplazmasında toplanır. Sonuçta; nöron ölümü Ekstrasellüler ortama Pr. Psc çıkışı Pr. Psc ile diğer nöronlar ya enfekte olur yada apoptoz gelişir Pr. Psc mikroglia hücrelerini aktive eder ve nörotoksik metaboliter açığa çıkar Astrositlerin aktivasyonu ile gliozis meydana gelir 40

KLİNİK BULGULAR Klinik olarak sessiz dönem ~ 20 yıl Başlangıç döneminde Hafıza kaybı Koordinasyon bozukluğu, motor kontrol kaybı Psikolojik bozukluklar İlerleyen dönemde Ciddi demans Ataksi, paralizi Ekstrapiramidal ve piramidal sistem ile ilgili bulgular Ensefalit Yaygın nöron kaybı 41

EPİDEMİYOLOJİ İnsan TSE olguları nadirdir CJD en sık rastlanan formudur Olgular; %85 -90 oranında sporadik %10 -15 oranında familial <%1 oranda iyatrojenik Epidemiyolojik sürveyansı yapılan ülkelerde de oran benzerdir İnsidans yılda 1 -1. 7/milyon kişi kadardır 42

EPİDEMİYOLOJİ İngiltere’de BSE olgularına bağlı gelişen yeni varyant Creutzfeldt-Jacob Disease (v. CJD) dışında, hayvanlardan insana geçen olgu saptanmamıştır Özellikle Slovakya ve İsrail’de geçmiş yıllarda saptanmış olguların, gelişen moleküler yöntemler ile kalıtsal olduğu gösterilmiştir ANCAK, İNSAN TSE BÜTÜN FORMLARININ, GENETİK FORMLAR DAHİL OLMAK ÜZERE BULAŞABİLECEĞİ UNUTULMAMALIDIR 43

RİSK FAKTÖRLERİ Doku grefti Kan transfüzyonu? Tedavi amacı ile insan, insan kanı, büyük ve küçük baş hayvandan hazırlanan ürünler Hastane sterilizasyon yöntemleri İngiltere’deki olgular; Gıda Tıbbi amaçla büyük baş hayvandan hazırlanan ürünler 44

WHO Scrapie risk faktörlerinin sınıflandırılması Kategori Enfektivite Doku /vücut sıvısı I Yüksek Beyin, spinal kord II Orta Dalak, tonsil, lenf nodu, ileum, proksimal kolon, plasenta IIIa Bazen Siyatik sinir, hipofiz, adrenal, distal kolon, burun mukozası IIIb Minimal BOS, timus, kemik iliği, karaciğer, akciğer, pankreas, beyaz küre IV Saptanmayan Çizgili kas, kalp, meme, süt, kolostrum, dışkı, böbrek, tiroid, tükrük bezi, over, uterus, testis, 45 seminal sıvı

PRİONLARIN KAN YOLU İLE BULAŞI Koyunda doğal yolla veya deneysel scrapie de, klinik öncesi ve klinik dönemde kanda saptanmış Hamsterlerde deneysel scrapie hastalığında düşük düzeyde “viremi? ”nin en az 40 gün sürebileceği gösterilmiş İnsan kan donörlerinde de, v. CJD klinik öncesi dönemde bulunabilir? ? ? 46

PRİON Filtreler UV (254 nm) Nukleaz Proteaz Divalen katyonlar Asit Radyasyon Kaynatma Kuru ısı Alkol Betapropionolakton Formalin DİRENÇLİDİR 47

PRİON İNAKTİVASYONU Proteazlar ile uzun süreli muamele Sodyum dodesil sülfat ve üre ile kaynatma 132°C otoklavda 4. 5 saat (enfekte doku) Guanidin izotiyosiyanat/ hidroklorid 4. 0 M Na. OH 1 N Na hipoklorid %2 132°C OTOKLAV 4. 5 SAAT 48

TIBBİ GÜVENLİK STERİLİZASYON ÖN TEMİZLİK; Otoklavda 134 -136°C – 20 dak (türler arasıda direnç farkı olabilir!!!) Sodyum hidroksit 1 -2 mol/l – 1 saat - 20 °C Sodyum hipoklorit %2 – 1 saat - 20 °C NORMAL STERİLİZASYON PROSEDÜRÜ Riskli bir hastaya cerrahi işlem yapılacaksa WHO önerileri dikkate alınmalıdır 49

İMMÜN YANIT Doğal enfeksiyon veya deneysel koşullarda humoral ve hücresel immün cevapta değişiklik olmaz Pr. P’ye karşı oluşan bir antikor cevabı yoktur Dolayısıyla, asemptomatik olguların saptanması bağışık yanıt aracılığı ile olası görülmemektedir 50

MİKROBİYOLOJİK TANI Humoral immün cevap oluşmaması nedeniyle, tanıda antikor oluşumunu gösteren kolay bir test bulunmamaktadır Olguların tanısı genellikle postmortem olarak konulmaktadır Prion 15 B 3 epitopuna karşı geliştirilen monoklonal antikor (m. Ab) ile tanı olasıdır 51

Prion 15 B 3 epitopu monoklonal antikor (m. Ab)ile Pr. PTSE tanısı 15 B 3 epitope Nature 390 (6655) : 74 -77, 1997 52

• + KROMOZOMAL POZİSYON ETKİSİ Doç. Dr. Sercan ERGÜN Tıbbi Biyoloji ABD

Position Effect Variegation 1930 - first described “The mosaic phenotype caused by a chromosomal position effect in which a rearrangement breakpoint displaced the white gene from its normal euchromatic location and placed it in the vicinity of heterochromatin” Wakimoto Cell 93: 321, 1998

Position effect variegation- pp 448, Alberts Definition- Translocation of a gene from a euchromatic region to a heterochromatic region resulting in inactivation of nearby heterochromatic genes. – Called “heterochromatic spreading”, but is an incomplete definition

• Position-effect Variegation • A heterozygote for a gene and a translocation can show variegated phenotype for that gene. • Position-effect variegation is exhibited by this w+/w heterozygote. • Wild-type allele is no longer wild-type in its expression in some of the eye facets. • Any chromosomal change that places a locus next to heterochromatin can result in inactivation of that gene. • A tissue or organ that is comprised of a mixture of cells that express one or the other phenotype exhibit this variegation.

Position Effect Variegation The white gene produces red eyes Variegated Wild-type Dorer and Henikoff Cell 77: 993, 1994

PEV- effect of transgene repeats • Single copy of “mini-white” locus inserted near centromere in null-white fly strain Heterochromatin Inverted repeat Single copy tandem repeat three repeats four repeats Thus, repeat number and orientation affect PEV

PEV can be suppressed by modifiers controls Six-copy mini-white gene at 50 C in Su(var)295 flys

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D Models of PEV A. Cis-spreading Note: Histone acetylation effects PEV 1. Cis-spreading, block factor binding 2. Cis-spreading, form repressor complex with factors Thus, more spreading = more variegation

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D Models of PEV A. Cis-spreading Problems with cis-spreading model • Some hetero-euchromatin rearrangements induce PEV several megabases away • PEV is sensitive to interchromosomal interactions • Thus, trans-interactions are suggested

Models B. Nuclear compartment model A trans-effect model Evidence in support- • Centromeres and most heterochromatin is located at one end of nucleus, telomeres at opposite end • Displaced heterochromatic regions interact with other heterochromatic regions – prevented by modifiers of PEV • However- have not yet correlated measured transcriptional activity and nuclear localization

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D How does PEV Occur? Lets look at Telomere Position Effect RAP 1 • Telomere Position Effect- Rap 1 in complex with SIR proteins (SIR 2/SIR 3/SIR 4) and histones H 4 + H 3 – Functions- heterochromatin assembly; recruitment of SIR proteins Folding-back mechanism

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D Models of PEV • Over 120 modifiers (enhancers and suppressors) of PEV identified • Only some are directly involved • HP-1, Su(var)3 -7 both co-localize to heterochromatin, interact in yeast two hybrid assay – Neither binds DNA

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D What about genes normally active in heterochromatin? • Flys have over 20 expressed genes located in heterochromatin • >7 of these genes require placement in heterochromatin for normal expression • If place into euchromatic region- PEV results! • 1/2 of mutations that suppress PEV of euchrom. genes also enhance PEV of heterochrom. genes

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D What about genes normally active in heterochromatin? Heterochromatin binding proteins interact with transcription factors to activate transcritpion or mediate longrange enhancerpromoter communication Thus, Rap 1 p may have repressor role in euchromatin, activator role in heterochromatin

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D How is PEV maintained? • No current model is satisfactory • Not DNA methylation -(Flys don’t do this) • GAGA protein binds to heterochromatin, remains throughout cell cycle • DNA must be “tagged” to maintain a given level of PEV during subsequent cell divisions • Competition for factors at each cell cycle?

Advanced Molecular and Cellular Biology Bio 4751 Spring 2003 Gary A. Bulla, Ph. D Recent result • What happens if have two genes (GFP and miniwhite) near centromere? Gal 4 -responsive Green Fluor. Protein Mini-white gene Centromere Ahmad and Henikoff, Cell 104: 839, 2001.

Ahmad and Henikoff, Cell 104: 839, 2001. GFP in near euchromatin heterochromatin • Observe GFP expression is variegated next to heterochromatin • And as increase High GAL 4 Gal 4, suppress variegation Low GAL 4 Euchrom. Heterochrom.

Ahmad and Henikoff, Cell 104: 839, 2001. What happens to a nearby gene (the mini-white gene)? Miniwhite in euchromatin GAL 4? No Yes Miniwhite near heterochromatin No Yes Thus, GAL 4 binding counteracts silencing at nearby mini-white locus

Ahmad and Henikoff, Cell 104: 839, 2001. Can GFP and mini-white variegation be uncoupled? Miniwhite near heterochromatin Note- GFP on, mini-white off!! • Thus, GFP and mini-white silencing can be uncoupled. ! • Heterochromatic boundary may be within 2 kb of DNA. • Heterochomatic spreading in not continuous