Prednka 3 Sveteln mikroskopia Fzov kontrast Charakteristika metdy

Prednáška 3 Svetelná mikroskopia Fázový kontrast

Charakteristika metódy Metóda fázového kontrastu je metóda pre zvýšenie kontrastu obrazu pozorovaného preparátu, založená na skladaní – interferencii- svetelných vĺn, ktoré sú vzájomne fázovo posunuté. Túto metódu prvý krát publikoval holandský vedec Frits Zernike v roku 1935. Za prínos tejto techniky v oblasti biológie a medicíny mu bola v roku 1953 udelená Nobelová cena. Najväčší prínos tejto metódy spočíva vo zvýšení kontrastu preparátov s nízkou schopnosťou absorbcie a difúzie svetla, tzv. fázových preparátov, teda predovšetkým biologických preparátov pozorovaných v prechádzajúcom svetelnom zväzku.

Interakcia prechádzajúceho svetla s preparátom pozorované látky rozdeľujeme podľa interakcie s dopadajúcim alebo prechádzajúcim svetlom na: • amplitúdové – pri prechode svetelného zväzku týmto materiálom dochádza k absorbcii svetla, čím sa zmenšuje amplitúda (intenzita) svetla (obr. a) • fázové – pri prechode svetelného zväzku dochádza k lomu svetla, čo spôsobuje fázové posunutie (obr. b) • opticky neutrálne – nedochádza k zmene amplitúdy ani fázy

Fázový posun fázového preparátu v svetlom poli λ/20 ~Δ Amplitúda Nedostatkom pri sledovaní fázových preparátov sa javí fakt, že fázový posun primárneho svetelného zväzku (S) a zväzku (P) vznikajúceho interferenciou medzi primárnym (S) a difúzne rozptýleným svetlom (D) je veľmi malý. Malý rozdiel vo fázovom posunutí spôsobuje vznik nepozorovateľného Φ φ λ/4 λ S vlna P vlna D vlna Fáza Keďže ľudské oko reaguje na zmeny amplitúdové, nie fázové, meníme fázové zmeny svetla na zmeny v amplitúde, teda zmeny intenzity. Tieto sú najvýraznejšie v prípade, že medzi primárnym (priamym - nedifraktovaným) zväzkom a jednotlivými difraktovanými zväzkami je fázový rozdiel ½ λ. Pri tomto posuve dochádza k maximálnemu zvýrazneniu oblastí vzorky, ktoré difúzne rozptyľujú svetlo. Fázový posun vytvorený pri interakcii svetla so vzorkou však nedosahuje ideálny fázový posun. Frits Zernike – Holandský fyzik – aplikoval techniku dodatočného fázového urýchlenia alebo spomalenia difraktovaného alebo primárneho svetelného zväzku a tým optimalizoval maximum fázového kontrastu.

Vznik fázového posunu – transparentný fázový preparát Fázové rozdiely Δ medzi svetelnými zväzkami, ktoré prechádzajú heterogénnym trasparentným preparátom, sú spôsobené rozdielnou dĺžkou optickej dráhy, ktorú lúče prejdú v prostrediach s hrúbkou t s rozdielnym indexom lomu svetla n a n´. λ/20 ~Δ s-wave n p-wave Amplitúda n´ λ/4 λ t Dráhový posun medzi dvoch lúčov svetla je možno vyjadriť ako: Δ = (n´ - n)×t Fáza Potom uhlový posun medzi fázami dvoch lúčov svetla je možno vyjadriť ako: φ = 2π × Δ/λ

Vznik fázového posunu – metalografický fázový preparát • fázové rozdiely medzi vlnami svetla odrazeného od metalografickej (nepriehľadnej) vzorky pri episkopickom osvetlovacom systéme spôsobujú výškové nerovnosti na povrchu vzorky • nerovnosti možno zviditeľniť využitím metódy fázového kontrastu – teda optimalizácie fázového posunutia primárneho zväzku svetla vzhľadom k difraktovanému. Rozdiel ich fázového posunu φ sa premietne na interferencii a fázovom súčte vĺn P S V prípade, že fázová zmena pri reflexii svetelných lúčov je v každom mieste vzorky rovnaká, možno t vyjadriť fázový rozdiel φ vzťahom: φ = 4π × t/λ t – reprezentuje výškový rozdiel medzi nerovnosťami odraz svetla nenastane súčasne od jednotlivých prvkov, fázový posun svetelných lúčov bude teda mierou nerovnosti

Fázová doštička Prstencová clona Vzorka Priamy zväzok, bez rozptylu vzorkou Prstencová clona vytvorí svetelný zväzok vo forme prstenca. Interakciou so vzorkou dochádza k vzniku difúzne rozptýlených lúčov. Priamy prstencový zväzok a difúzne rozptýlené lúče prechádzajú fázovou doštičkou. Výsledkom interferencie lúčov svetla s optimalizovaným fázovým posunom v obrazovej rovine je interferenčný obrazec, vytvorený zložením jednotlivých svetelných vĺn (vektory svetla sa buď spočítajú alebo odpočítajú) so zmenenou amplitúdou, čím dôjde k zmene intenzity svetla a objekt difúzne rozptyľujúci svetlo sa stane kontrastný – viditeľný. Zväzok difúzne rozptýlený vzorkou Do osvetľovacej sústavy sa vkladajú prstencová clona (je vložená v prednej fokálnej rovine kondenzorovej šošovky) a fázová prstencová doštička (uložená v zadnej fokálnej rovine poslednej objektívovej šošovky), ktorá má v strednej časti naparenú vrstvičku, ktorá spôsobuje fázové posunutie svetla o 90° Fázová doštička Osvetľovacia sústava mikroskopu s diaskopickým osvetľovacím systémom Prstencová clona

Pozitívny a negatívny fázový kontrast Ak sa na fázovej doštičke stáča vektor svetelného zväzku v protismere hodinových ručičiek, hovoríme o pozitívnom fázovom kontraste – objekt je tmavší ako pozadie. Pozitívny Svetlé pole Fázové doštičky Ak nastáva posun v smere hodinových ručičiek, hovoríme o negatívnom fázovom kontraste – objekt je svetlejší ako pozadie. Vektory Negatívny Obraz

Využitie v metalografii sledovanie nerovností vznikajúcich pri deformácii alebo únavových skúškach na rozlíšenie niektorých typov karbidov alebo intermediárnych fáz po naleptaní (napr. Cr-Ni oceľ, δ-fáza) pri sledovaní štádií tečenia – sklz po hraniciach zŕn na sledovanie reliéfu povrchu (povrchový reliéf) zviditeľniť sa dajú aj veľmi malé výškové nerovnosti až 1 -5 nm v smere optickej osi. Nedajú sa však presne merať. Vmestky v austenitickej oceli

Princíp interferenčnej mikroskopie • Princíp metódy – spočíva v hodnotení interferencie medzi lúčom odrazeným od sledovaného povrchu a lúčom odrazeným od porovnávacieho povrchu. • Pri metóde sa sveteľný lúč rozkladá na 2 alebo viac lúčov, ktoré sa po prekonaní rôznych optických dráh opäť spájajú a navzájom interferujú. Podľa toho poznáme interferenčné metódy: – dvojlúčová – viaclúčová

Dvojlúčová metóda Svetelný lúč sa štiepi na dva lúče pomocou optického hranolu, pričom oba lúče dopadajú na navzájom kolmé a od hranolu rovnako vzdialené reflexné plochy. Jednou z reflexných plôch je pozorovaná vzorka, druhou je porovnávací povrch. Oba lúče sa od reflexných plôch odrazia a znova sa spájajú do jedného lúča a navzájom interferujú. Ak nie sú reflexné plochy kolmé alebo nie sú rovnako vzdialené od stredu hranola, bude zorné pole tmavé alebo svetlé, podľa fázového rozdielu sveteľných lúčov (pretože lúče prekonávali rozdielne vzdialenosti). Ak len jedna z reflexných plôch bude odklonená od kolmého smeru prejaví sa to v zornom poli vznikom rovnobežných tmavých a svetlých interferenčných prúžkov v zornom poli. Na zlepšenie podmienok interferencie používame Zo vzájomnej vzdialenosti interferenčných sklenené doštičky, ktoré vkladáme zväzkov možno posudzovať sklon povrchu do optického systému. objektu a merať výšku nerovnosti.

Viaclúčová metóda Pred vzorku sa vkladá sklenená doštička so striebrom napareným povrchom (hrúbka naparenej vrstvy je asi 50 nm), s vysokou odrazivosťou. Doštička je umiestnená v tesnej blízkosti vzroky, pod určitým sklonom k jej povrchu. Pri dopade svetelného lúča nastáva medzi povrchom doštičky a povrchom vzorky mnohonásobná reflexia, pričom po každom odraze prejde naparenou vrstvičkou asi 10% intenzity pôvodného zväzku a interferuje s lúčom, ktorý sa priamo odráža od vrstvy striebra. Vznik veľkého množstva navzájom interferujúcich lúčov má za následok vznik ostrých interferenčných prúžkov. Metóda je preto vhodná aj na stanovenie veľmi malých nerovností povrchového reliéfu. Čím je sklon doštičky menší (uhol α) vzhľadom k povrchu vzorky – tým je väčšia citlivosť metódy.

Viaclúčová metóda Interferenciou dochádza k zosilneniu paprskov, ak je rozdiel dráhy 2 t rovný mλ, kde m je celé číslo a λ je vlnová dĺžka použitého svetla. t = x × tg α kde α je uhol medzi rovinnou doštičkou a povrchom vzorky x je vzdialenosť od vrcholu uhla α. Zosilnenie interferencií sa uskutoční keď x × tg α = mλ/2 Podľa tejto podmienky sa vytvorí rada rovnobežných interferenčných prúžkov vzdialených navzájom o Δx = (λ/2) cotg α Aplikácia: Sledovanie povrchových zmien v dôsledku plastickej deformácie, koróznych povrchov, fázových transformácií. Štúdium morfológie leptových jamiek (napríklad pre hodnotenie hustoty dislokácií, pre odvodenie orientácie zŕn)

Nomarski DIC

DIC vs. Fázový kontrast • Využíva sa na štúdium fázových vzoriek podobne ako fázový kontrast • Umožňuje štúdium aj hrubších preparátov • Netrpí typickým artefaktom fázového kontrastu v podobe presvetlenej centrálnej časti zorného poľa • Umožňuje využiť plne otvorenú kondenzorovú a objektívovú apertúru

Princíp diferenčného interferenčného kontrastu DIC Základná konfigurácia predstavuje polarizačný mikroskop, ktorý je doplnený o dve Nomarského (modifikované Wolastonové) prismy

Princíp DIC • Rozdiel v dráhe lúčov možno popísať stanoviť na základe indexu lomu svetla vzorky a obklopujúceho prostredia a pomocou hrúbky vzorky rovnako, ako v prípade fázového kontrastu • Vzorka je analyzovaná dvojicou čiastočne koherentných ortogonálnych lúčov, ktorých vzdialenosť je tesne pod rozlišovacou schopnosťou mikroskopu • Lúče sú vytvorené prvou Nomarského alebo Wollastonovou prismou • Po prechode vzorkou v oblasti s nerovnakým indexom lomu prostredia dôjde k čiastočnej zmene – fázovému posunu lúčov • Pri rekombinácii v ďalšej prisme a v analyzátore dochádza k vzniku modifikovaného kontrastného obrazu

Princíp DIC Wollastonová prizma Nomarského prizma Rekombinácia vlnoplôch prechádzajúcich rôznymi oblasťami vzorky

Využitie Čiastočne naleptané Si. O 2 Leptaný grafit – špirálové rastové čiary

Confocal Laser Microscopy CLM

Historický rozvoj LCM • Pôvodný návrh princípu konfokálnej mikroskopie pochádza od Marvin Lee Minsky (1927) a bol patentovaný v roku 1957 • Návrh zostal nepovšimnutý z dôvodu absencie dostatočne intenzívnych zdrojov svetla a tiež nízkeho výkonu počítačov • Dalšie návrhy a zlepšenia – David Egger a Mojmir Petran zo 60 a 70 rokov prispeli k rozvoju tejto techniky predovšetkým aplikáciou Nipkových diskov a prvých laserových skenovacích jednotiek • Prvé komerčné mikroskopy sa objavili začiatkom 80 rokov

Výhody CLSM vs. konvečná mikroskopia • Riadená hĺbka ostrosti • Eliminácia alebo potlačenie vplyvu signálu pozadia z rovín, ktoré sa nachádzajú mimo aktuálnej ohniskovej roviny • Schopnosť zaznamenávať sériové snímky reprezentujúce optické rezy hrubších vzoriek

Optická cesta konfokálneho lúča • • • Svetlo je z laserového zdroja cez dichroické zrkadlo a objektív focusované do ohniskovej roviny, ktorá predstavuje malý objem študovaného materiálu. Lúče, ktoré sú z akéhokoľvek dôvodu širšie než je vstupný otvor clony detektora- pinhole Signál z každého melého študovaného objemu je zaznamenaný fotonásobičom (PMT detektor) Stefan Wilhelm, Bernhard Gröbler, Martin Gluch, Hartmut Heinz: Confocal Laser Scanning Microscopy, Carl Zeiss

Dva základné typy konfokálnych mikroskopov Konfokálny laserový skenovací mikroskop Viaclúčový viacbodový konfokálny laserový mikroskop

Zobrazenie Klasický mikroskop Konfokálny mikroskop

Rozlišovacia schopnosť • Z- rozlišovacia schopnosť v optickej osi • Laterálna optická rozlišovacia schopnosť

2 D a 3 D zobrazenie Peľové zrnko

Základné (orientačné) parametre • Veľkosť osvetľovacej stopy – Laterálna 0. 25 – 0. 8 μm – Axiálna 0. 5 – 1. 5 μm – Rýchlosť načítania obrazu 2 -200 μs/pixel