Pia Fondazione di Culto e Religione Card G

Pia Fondazione di Culto e Religione Card. G. Panico Azienda Ospedaliera – Tricase (Lecce) Dipartimento di Neurologia Clinica e Ricerca U. O. Malattie Neurodegenerative U. O. Medicina di Laboratorio (Direttore: Prof. G. Logroscino) Diagnostica liquorale Dott. ssa Chiara Zecca 21 Febbraio 2017

LIQUIDO CEFALO-RACHIDIANO (CEREBRO-SPINALE o LIQUOR) Liquido limpido e incolore prodotto dall’ attività di filtrazione e secrezione dei capillari dei plessi corioidei, circolante in tutte le cavità del nevrasse e nello spazio subaracnoidale

Il LCR è prodotto da plessi corioidei e da questi passa nel 3° e 4° ventricolo

Attraverso i fori di comunicazione si porta negli spazi subaracnoidali cerebrali e spinali

• Volume = 90 -150 m. L • Velocità di produzione= 0, 35 ml/minuto • Produzione/die = 500 ml • Rinnovamento nelle 24 h= 3 -4 volte • Gradiente rostro-caudale

FUNZIONI DEL LIQUOR • Difesa meccanica del SNC (protegge il nevrasse come un cuscinetto liquido dalle sollecitazioni meccaniche legate alle variazioni di movimento e di posizione del capo nello spazio) • Contribuisce alla regolazione della pressione intracranica • Fornisce nutrimento al sistema nervoso • Rimozione dei prodotti del catabolismo cerebrale (CO 2, lattato) • Mantenimento dell’omeostasi fra compartimento encefalico e plasmatico.

La barriera emato-encefalica (BEE) Unità morfo-funzionale che: ü isola il liquido cerebrospinale (LCR) ed il tessuto nervoso dalla circolazione ematica ü mantiene il delicato equilibrio chimico-fisico del LCR

Il prelievo del liquido cefalo-rachidiano generalmente si pratica mediante: Rachicentesi o puntura lombare

Principali indicazioni cliniche per la puntura lombare v Meningiti e meningoencefaliti v Sclerosi multipla ed encefalomieliti demielinizzanti v Poliradicolonevriti immunomediate v Carcinomatosi meningea v Malattie infiammatorie/autoimmuni sistemiche con implicazione neurologica v Vasculiti del sistema nervoso centrale v Neurosarcoidosi v Sospetta emorragia subaracnoidea TAC-negativa v Blocco del flusso liquorale v Oto/rinoliquorrea v Sindrome di Guillain-Barré v Malattie neurodegenerative (Malattia di Alzheimer, M. di Creutzfeldt-Jacob, etc…)

RACHICENTESI A SCOPO TERAPEUTICO: • per ridurre la pressione intracranica in caso di idrocefalo (accumulo di liquor nelle cavità ventricoli cerebrali) • somministrare medicinali direttamente all'interno dello spazio subaracnoideo (es. anestesia spinale, chemioterapia).

Procedure operative pre-analitiche per la diagnostica liquorale • La puntura lombare, per quanto possibile, deve essere eseguita la mattina con paziente a digiuno. • Le operazioni devono essere eseguite in condizione di sterilità. • Paziente in decubito laterale (o seduto) con il rachide iperflesso. • Puntura a livello dello spazio L 4 -L 5 (o L 5 S 1). • Uso di anestetico locale iniettabile o spray • Ago sottile (calibro: 22 -24 mm).

• La raccolta del liquor non deve avvenire per aspirazione, ma per caduta spontanea nelle provette aperte al momento dell’uso e subito richiuse con lo stesso tappo sterile. • Tutti i campioni di liquor devono essere raccolti in provette di polipropilene siliconato a fondo conico (per evitare l’adesione delle cellule alle pareti interne delle provette) • Il volume complessivo di liquor dovrebbe essere di circa 8 ml nell’adulto e va distribuito in 3 provette preventivamente numerate ed utilizzate secondo la successione numerica. • Il set di provette di liquor deve essere sempre corredato da una provetta per siero da sangue periferico

• Quando sussiste un sospetto di meningite o meningo-encefalite ad eziologia microbica è opportuno eseguire emocolture con flaconi per batteri aerobi ed anaerobi. • In tal caso, aggiungere un’altra provetta di siero e 3 per emocromo al fine di permettere lo studio dell’assetto anticorpale specifico e la eventuale determinazione di genomi microbici. • Nel caso di sospetta meningite da meningococco è indicata la esecuzione del tampone faringeo in quanto nel 50% dei casi il microrganismo può essere isolato dalle secrezioni faringee. • I campioni di liquor e sangue devono pervenire in laboratorio entro 15 -30 minuti dal prelievo per minimizzare i processi di degenerazione cellulare.

Controindicazioni: • Ipertensione endocranica • Gravi coagulopatie • Infezioni nella sede del prelievo (Es. Infez. cutanee da miceti) • Spondiloartrosi deformante lombo-sacrale Complicanze: § Cefalea § Sanguinamento subaracnoideo § Algie lombari § Sindrome radicolare

DIAGNOSTICA LIQUORALE Procedure operative analitiche Ø Analisi macroscopica (valutazione visiva) Ø Analisi microscopica (conta ed esame morfologico degli elementi cellulari e di eventuali microrganismi) Ø Analisi microbiologica (colture batteriologiche, fungine, isolamento di virus) Ø Analisi biochimica (determinazione del glucosio, lattato, proteine, immunoglobuline)

Ø Analisi macroscopica Valutazione visiva del liquor Il campione liquorale deve essere valutato per aspetto e colore, prima e dopo centrifugazione Aspetto e colore sono espressi attraverso scale qualitative Colore Aspetto Incolore Limpido Bianco Opaco Rosa Torbido Rosso Ematico Giallo Viscoso Arancione Coaguli e filamenti Verde Globuli di lipidi Marrone Limpido e incolore

Colore Incolore Rosa Rosso Giallo Arancione Verde Marrone Causa Emazie Derivati dell’emoglobina Bilirubina Melanina Emoglobina Bilirubina Melanina Iperbilirubinemia LCR purulento Melanina Probabile significato clinico Normale Presenza di sangue (emorragia o traumatismo da prelievo) Xantocromasia vera (emorragia) Xantocromasia falsa (proteine ≥ 150 mg/dl, , iperbilirubinemia, prematurità, melanoma meningeo) Ingestione di alimenti con alto contenuto in carotenoidi Ittero Grave processo infettivo Melanoma meningeo emoglobina bilirubina

Aspetto ematico (rosa-rosso) o xantocromico Ø Indica la presenza di sangue o di pigmenti ematici nel LCR. Ø In questi casi è necessario stabilire se il sangue è presente per: - - puntura accidentale di un vaso - emorragia subaracnoidea (ESA) Si prelevano 3 campioni di LCR in provette diverse: 1. TRAUMA: le provette successive saranno più chiare delle precedenti 2. ESA: tutte le provette sono ugualmente colorate Dopo centrifugazione: 1. TRAUMA: il supernatante sarà limpido ed incolore 2. ESA: il supernatante sarà xantocromico

Aspetto Limpido Opaco Torbido Ematico Viscoso Coaguli e filamenti Globuli di lipidi Causa Probabile significato clinico Normale Leucociti Microrganismi Proteine Meningite Produzione intratecale di immunoglobuline Leucociti Microrganismi Proteine Emazie Meningite Produzione intratecale di immunoglobuline Emorragia Traumatismo da prelievo Criptococcosi Metastatizzazione di carcinomi producenti mucine Traumatismo da prelievo (annulo fibroso) Polisaccaridi capsulari Muco Liquido nucleo polposo Fibrinogeno Micelle lipidiche Sindrome di Froin Meningite suppurativa Meningite tubercolare Embolia gassosa

Ø Analisi microscopica Conta ed esame morfologico degli elementi cellulari e di eventuali microorganismi È fondamentale per l’inquadramento diagnostico, poichè un’alterata cellularità è sempre indicativa di un processo patologico in atto. I valori variano in età neonatale e pediatrica

Cellule leucocitarie liquorale (Pleiocitosi) e quadri clinici Linfociti Monociti Macrofagi Meningite virale, meningite batterica in fase tardiva o in trattamento, tubercolosi, sifilide, leptospirosi, micosi, parassitosi, ascesso cerebrale integro Sarcoidosi, Emorragie, trombosi, avvelenamento da piombo, uremia, malattie croniche del SNC, tumori cerebrali Meningite batterica cronica o trattata, sifilide, micobatteriosi, virosi, micosi, leptospira, amebiasi Emorragie, infarti del SNC, reazione a corpo estraneo, tumori del SNC Tubercolosi, micosi, meningite in risoluzione Post-emorragia, post-chirurgia, istiocitosi benigna/maligna, cisti, neoplasie, malattie da accumulo Granulociti neutrofili Meningite batterica, stato infettivo iniziale, Precedente rachicentesi, emorragia, meningite cacinomatosa, corpi estranei, epilessia Granulociti eosinofili Parassitosi, meningite subacuta, micosi Corpi estranei, ipersensibilità, allergie, tumori del SNC, Linfoma/leucemie, Eosinofilia idiopatica Plasmacellule Neurosifilide, tubercolosi, infezioni virali Sclerosi multipla, sarcoidosi, panencefalite sclerosante subacuta, altri processi patologici

Ø Analisi microbiologica Esame colturale Semina su specifici terreni di coltura Allestimento di vetrini e colorazione di Gram Analisi microscopica Ricerca di antigeni batterici solubili una agglutinazione visibile indica un risultato positivo

Ø Analisi biochimica Determinazione di glucosio, lattato, proteine, immunoglobuline Le determinazioni, di norma, sono da effettuare su campioni appaiati di liquor e siero GLUCOSIO LIQUORALE (GLICORRACHIA) • Maggiore sorgente di energia per il tessuto nervoso • Superamento BEE mediante sistema di trasporto attivo • Concentrazione di glucosio liquorale direttamente proporzionale a quella ematica Qglu= glucosio liquor / glucosio siero x 100 > 45 (range 50 -60%) Iperglicemia Ipoglicemia, Meningite batterica, micotica, tubercolare Meningiti neoplastica Emorragia subaracnoidea (ESA) Ischemia cerebrale

LATTATO • Origina dal metabolismo del glucosio in condizioni anaerobiche e viene prodotto dalla normale attività metabolica cerebrale. • Non attraversa la BEE • La sua concentrazione nel LCR è indipendente dalla concentrazione plasmatica. Lattato (LCR) < 25, 2 mg/d. L • Il lattato liquorale è un marcatore biochimico ritenuto più sensibile nell’identificazione delle meningiti batteriche • Nelle meningiti infettive l’aumento delle concentrazioni di lattato liquorale è la conseguenza del metabolismo batterico e leucocitario. Meningite batterica (diagnosi differenziale con la meningite virale) ESA Infiammazione Carcinomatosi meningee Ictus Encefalopatie mitocondriali

PROTEINE TOTALI (PROTIDORRACHIA) ü Nel liquor di un adulto le proteine totali hanno una concentrazione tra 15 e 45 mg/d. L ü Valori più elevati si trovano nei neonati e negli immaturi per l’incompletezza della membrana ematoencefalica e negli anziani ü 80% di origine sierica ü 19% dall’epitelio del plesso ü 1% dal tessuto celebrale. Meningite batteriche (>150 mg/dl) Meningite criptococcica (30 -300 mg/dl) Meningite virale (300 -400 mg/dl) Meningite da micobatteri (20 -1500 mg/dl) Emorragia subaracnoidea Ascesso Encefalite Neoplasie Sindromi demielinizzanti AUMENTO DI PROTEINE: “danno di barriera” : identifica qualsiasi condizione patologica che comporta un aumentato passaggio di proteine dal plasma nel liquor. “sintesi intratecale” : qualsiasi condizione che comporta un aumento di proteine liquorali per aumentata produzione nel SNC. La produzione avviene esclusivamente all’interno della barriera ematoencefalica.

ALBUMINA ü Proteina presente in concentrazioni maggiori: ~ 57% delle proteine totali ü Sintetizzata esclusivamente dal fegato ü la sua misura è ritenuta il migliore indicatore riguardo la funzionalità della barriera emato-encefalica Qalb= albumina liquor / albumina siero x 100 ü I valori di riferimento per il danno di barriera non sono applicabili nella prima infanzia e nella popolazione anziana in quanto la barriera emato-encefalica diventa fisiologicamente più permeabile. < 6, 5

IMMUNOGLOBULINE (Ig. G – Ig. M - Ig. A) § Indice di una condizione infiammatoria del sistema nervoso centrale, - risposta ad una eziologia infettiva - attivazione del sistema immunitario. § Nel corso del processo infiammatorio i linfociti B migrano nel sistema nervoso centrale e producono immunoglobuline che si riversano in prima istanza nel liquido cefalorachidiano § Le immunoglobuline di sintesi intratecale si sommano a quelle già presenti per diffusione di barriera Importante è differenziare la componente di sintesi intratecale INDICI LIQUORALI

Ig. G Index = § Ig. G Index Ig. GCSF Ig. GSiero / Albumina. CSF Albuminasiero = < 0, 7 aumentata produzione di Ig. G da parte del SNC e intatta barriera emato-liquorale (meningiti virali, SM, Sindrome di Guillain- Barré)

Pattern di risposta immune anticorpale nel SNC Patologia Ig. G, Ig. A, Ig. M nella norma Stadi precoci di meningite batterica o virale Poliradicolite di Guillain-Barrè Dominanza di Ig. G Sclerosi multipla (bassa frequenza di Ig. M, 25%, ed Ig. A, 9%) Neurosifilide (bassa frequenza di aumento delle Ig. M, assenza di Ig. A) Encefalite cronica da HIV Dominanza di Ig. A Neurotubercolosi (dominanza di Ig. A con debole risposta Ig. G) Ascesso cerebrale Adrenoleucodistrofia Dominanza di Ig. M Neuroborreliosi di Lyme (Ig. MSI>Ig. ASI>Ig. GSI) Meningoencefalite da Ig. G + Ig. A + Ig. M parotite Linfoma non-Hodgkin del SNC (sintesi di Ig. M isolata, Ig. MSI>0) Infezione opportunistica (CMV, toxoplasmosi)

ISOELETTROFOCUSING • Analisi qualitativa della sintesi intratecale di immunoglobuline • Tecnica separativa raccomandata per la determinazione delle bande oligoclonali Ig. G (Consensus Europeo, 1994) • Le proteine vengono separate in base al loro punto isoelettrico (PI) , valore di p. H in cui una proteina ha carica netta uguale a zero • Siero ed LCR devono essere studiati in parallelo sullo stesso gel alla stessa concentrazione Type 1 Nel test vengono confrontate le Ig. G presenti nel liquor e nel siero dello stesso paziente. Type 2 Dal confronto della corsa effettuata in parallelo di liquor e siero si possono attendere 5 profili Type 4 Type 3 Type 5

Type 1 Tipo 1 – normale Risultati falsamente negativi per la presenza di bande oligoclonali possono essere legati a un traumatico campionamento liquorale o a una grave disfunzione della barriera ematoencefalica

Type 2 Tipo 2 – sintesi intratecale con presenza di bande oligoclonali (almeno 2) esclusivemente liquorali Si riscontra classicamente nei processi infiammatori cronici, come sclerosi multipla, encefaliti erpetiche e nella panencefalite sclerosante subacuta

Type 3 Tipo 3 – sintesi intratecale con presenza di bande oligoclonali esclusivamente liquorali e, in aggiunta, di bande uguali nel siero e nel liquor Riconducibile a un processo infiammatorio acuto o subacuto, come le encefaliti virali. Le bande oligoclonali nel siero e nel liquor indicherebbero nel compartimento sistemico plasmacellule attivate contro l’agente patogeno ed una risposta immunitaria umorale non ancora ristretta nel SNC

Type 4 Tipo 4 – assenza di sintesi intratecale, presenza di bande oligoclonali uguali nel siero e nel liquor (Mirror Pattern) Profilo sostenuto da una malattia sistemica ad andamento cronico e con possibile interessamento del SNC (neuro-LES, sarcoidosi, malattia di Behcet). Può accompagnarsi alla dissociazione albumino-citologica nella sindrome di Guillain-Barrè, ma esclude la diagnosi di sclerosi multipla

Type 5 Tipo 5 – gammapatie monoclonale, presenza di bande uguali nel siero e nel liquor Profilo sostanzialmente identico al Tipo 4 che riflette l’alta sensibilità del metodo in grado di discriminare proteine che differiscono di 0. 01 unità PI Type 1 I profili 2 e 3 sono considerati Positivi I profili 1, 4 e 5 sono considerati Negativi Type 2 Type 3 Type 4 Type 5

SCLEROSI MULTIPLA Standardizzazione dell’analisi liquorale nella diagnosi di sclerosi multipla. Isoelettrofocusing (IEF) su gel di agarosio GOLD STANDARD

Ø Malattia infiammatoria cronica del SNC Mediata dal sistema immunitario, che attacca la sostanza bianca e provoca aree focali di demielinizzazione e perdita neuronale Placche di demielinizzazione (SM) PATTERN LIQUORALE Moderata iperproteinorrachia (0. 5 -0. 7 gl) • Nel liquor compaiono frazioni di Ig. G, assenti nel siero. • L’assenza delle bande nel siero indica una esclusiva sintesi anticorpale nel SNC (90% dei casi). Aumentati livelli Ig. G No danno BEE Moderata pleiocitosi (10 -20 cmm 3) Indice Ig. G Sintesi intratecale Ig. G bande oligoclonali

Malattie infiammatorie e autoimmuni del SNP GANGLIONITI Processi infiammatori delle radici dorsali o dei gangli del tronco encefalico POLIRADICOLITI Processi infiammatori delle radici nervose POLINEVRITI Processi infiammatori dei nervi periferici MIOSITI Processi infiammatori del muscolo CAUSE INFETTIVE O IMMUNITARIE

Sindrome di Guillain-Barrè • Poliradiculoneuropatia infiammatoria demielinizzante • Esordio acuto o subacuto di un deficit motorio (distale e simmetrico) • Rapida evoluzione: giorni o settimane PATTERN LIQUORALE Iperproteinorrachia (0. 5 -0. 7 gl) Aspetto xantocromico Danno BEE No pleiocitosi Dissociazione albumino-citologica Assenza di sintesi intratecale Presenza di bande oligoclonali uguali nel siero e nel liquor (Mirror Pattern)

MENINGITI Malattie infiammatorie delle membrane che avvolgono l’encefalo e gli spazi interposti CAUSE Agenti infettivi (batteri, virus, miceti, protozoi) Agenti fisici Agenti chimici

CLASSIFICAZIONE DELLE MENINGITI IN BASE AL QUADRO LIQUORALE BATTERICA VIRALE Ø Aspetto TORBIDO LIMPIDO Ø Cellularità Tipo di cellule 1000 -5000/mm 3 100 -1000/mm 3 Neutrofili Linfociti 5 -10 g/L 0. 8 -1 g/L < 40 mg/dl 40 -80 mg/dl ≤ 23% > 40% Ø Protinorrachia Ø Glucosio Ø Ratio gluliquor/glusiero Esame microscopico Ricerca diretta dell’agente eziologico Esame colturale del liquor

MALATTIE NEURODEGENERATIVE J. Clin. Invest. Lars Bertram, et al. 115: 1449

BIOMARCATORI LIQUORALI DI NEURODEGENERAZIONE Marcatori di deposizione di amiloide di danno neuronale liquorali A 42 - t-tau - p-tau di neuroimaging Pi. B-PET - atrofia del LTM con RMN - [18 F]FDG-PET cerebrale L’utilizzo combinato di β-amiloide e tau ha mostrato un’elevata capacità di discriminare tra M. di Alzheimer e altre forme di demenza, con sensibilità e specificità variabili tra 80% e 90% Biomarcat ore A 42 ttau p- Valori patologici <500 ng/l >350 ng/l >61 Humpel 2011