Pesquisas em genoma funcional Revoluo da pesquisa na

Pesquisas em genoma funcional “Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas Quando? Porque? Década de 90 Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante - Barateamento do preço dos sequenciamento Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas Fatos: - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila completamente sequenciado - Genoma do camundongo completamente sequenciado - Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies

Consequências atuais - Grande quantidade de informação disponível - Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010 - Análise científica mais holística Consequências futuras: - Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas - Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo Compreensão da base genética da evolução: : : melhor compreensão da diversidade da vida na terra Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema

Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos Descoberta de genes Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas Estudo expressão gênica em larga escala c. DNA macro/microarrays; genechips Seleção de mutantes EMS, radiação, T-DNA, transposons Data mining Clonagem e sequênciamento Criação e análise de um banco de dados Posição no mapa gen. ou físico; Baseado na inserção de sequência alvo Estudos das interações Sistema duplo-hibrido de leveduras Phage display Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação Estudos de expressão in situ Fusão proteína com GFP Testes funcionais Complementação leved. Mutante em Arabidopsis Superexpressão Antisenso. Supressão por RNAi Estudos genéticos Alelismo Epistasia Aditividade Supressão Expressão GFP ou luciferina com o promotor Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas Construção de modelos de controle dos processos envolvidos Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultânea da expressão de vários genes

Transcriptoma: Análise dos níveis de RNA de varios genes simultaneamente Um genoma possui varios transcriptomas …varios transcriptomas temporais Ex: tempo apos sujeicao a um estresse Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento …varios transcriptomas espaciais Ex: transcriptoma celular-especifico Ex: transcriptoma tecido-especifico Ex: transcriptoma orgao-especifico

Etapas para a realizacao de um transcriptoma

1) Filme Macroarray. mov 2) Filme oligochip. mov

1 a Etapa de um transcriptoma Isolamento de DNA do banco de c. DNA Preparacao do Micro/Macroarranjo (Micro/macroarray)

2 a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda Duração do protocolo: 5 horas

2 a Etapa de um transcriptoma: hibridação

3 a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem DNA alvo imobilizado: c. DNA do genótipo tolerante Sonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresse Sonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse Gene com reduzida expressão na presença do estresse a Typhoon: Fosforescência, quimioluminescência; fluorescênica b d Gene expressão acentuada na presença do estresse Nível de expressão na presença do estresse: a) + x% b) + y% (y>x) c) -z% Genes sem alteração na expressão

3 a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem 1 5 1 2 3 4

Exemplo de data mining Agrupamento Dinamica da expressao Identificação de sequências regulatórias 5247 genes alvos sondas: 5 pontos temporais 6626 genes alvos 19 sondas Caracterizacao gene/rota 197 genes orgão-específico raiz=64 Matriz da folha=94 expressão flor=36 nos orgaos influorescencia=3 Agrupamento de expressão 347 genes constitutivos Analise da abundância global do transcrito 8300 genes alvos Sondas: Descoberta da função de genes desconhecidos Análise da homologia das sequências Análise da biologia molecular do gene: coregulação? Confirmação pela genética reversa folha =6 raizes=4 flores=2 Siliqua=3 Influorescencia=2 Plantula=2 Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39, 221 -241

Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses ambientais em Arabidopsis Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses

Análise de Grupos: 2 genótipos Genótipo sensível ao estresse salino: IR 29 (direita) Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)

Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular

Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator transcripcional DREB 1 A Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator transcripcional DREB 1 A

Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot

Classes de genes afetadas pelo estresse salino

Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis Sonda 1 e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno

Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes Vantagens: - estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada

Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress 8100 genes (Genechip) Raízes: 3 horas após Genes > 2 x = Total 2678 Genes 4 o. C Controle Meio Fresco 741 genes 58% Na. Cl (100 m. M) Manitol (200 m. M) 4 o. C 2086 genes 235 1008 genes 1123 genes 46% 42% 78 53% 29 65 375 Na. Cl 106 85 Manitol

Folhas: 3 horas após Raízes: 3 horas após 4 o. C 235 243 78 29 65 78 29 375 65 120 Na. Cl 68 Na. Cl 279 Manitol 106 85 Manitol

Raízes: 27 horas após Folhas: 27 horas após 4 o. C 1111 59 1094 47 23 90 5 19 9 87 Manitol Na. Cl 4 59 63 Manitol Na. Cl Raízes: 3 horas após 4 o. C Folhas: 3 horas após 4 o. C 235 243 78 78 29 375 106 29 65 65 Na. Cl 82 120 85 Manitol Na. Cl 68 279 Manitol

Estresse salino: por frio: sobreposição 3 -27 h Estresse h na raiz Raízes: Sobreposição entre 3 e 27 h Folhas: Sobreposição entre 3 e 27 h 4 o. C 173 9 188 5 8 2 22 Na. Cl 4 40 8 5 6 Manitol Na. Cl 4 40 Manitol

Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0, 5% (3 -27 h) 200 m. M Manitol=100 m. M Na. ClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato) Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estresses Mais induzido gene ELIP: liga a chl a Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas 3 -> 27 h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state” Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse: ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇ Pistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF 1 e ABA 2 sim folha, não raiz Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF 1 e DREB 1: a) Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores b) Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.

Identificacao de genotipos tolerantes e susceptiveis Transcriptoma e proteoma Caracteriz. do fenotipo Segregacao alelica Mapeamento de populacoes Transcriptoma Proteoma Caracteriz. do genotipo QTL Identificacao de genes e proteinas associados a tolerancia Selecao assistida por marcadores Locus genico candid. Locus quant. transcrito Locus quant. proteina Mapa genetico Identificacao de genes/marcadores ligados a tolerancia Melhoramento molecular Transformacao

Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma Em colaboracao: Instituto de Quimica USP Embrapa-Cenargem Unicamp UNESP-Araraquara Realizado na UFV

Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes Melhores resultados