GENES GENOMAS Y TCNICAS DE INGENIERA GENTICA CON

GENES, GENOMAS Y TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA. . . CON UN TOQUE DE BIOINFORMÁTICA

CÓDIGO GENÉTICO DNA Doble Hélice Retrotranscripción m. RNA 5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3' Hebra codificadora 3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5' Hebra no codificadora TRANSCRIPCIÓN 5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3' TRADUCCIÓN Proteína (NH 2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)

GENES Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos. Un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica. Por ejemplo: Proteínas, ARNm, ARN ribosómico, ARN de transferencia y ARN pequeños.

GEN PROCARIOTA

m. RNA POLICISTRÓNICOS

GEN EUCARIOTA

GENOMAS El genoma es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular. EUCARIOTAS CROMOSOMA MITOCONDRIAS CLOROPLASTOS

GENOMA HUMANO 3200 MB

Organismo Tamaño Genoma(pares de bases) Fago λ 5× 104 Escherichia coli 4× 106 Levadura 2× 107 Caenorhabditis elegans 8× 107 Drosophila melanogaster 2× 108 Humano 3× 109 Amphibians 109– 1011 Psilotum nudum 2. 5 x 1011

C-value enigma ó C-value paradox El C-value enigma ó C-value paradox es un término usado para describir la variación en los tamaños de genomas nucleares entre las especies eucariotas. El objeto de estudio del C-value enigma es la observación de que el tamaño del genome no se correlaciona con la complejidad del organismo.

EJERCICIO Hacer un programa que a partir del archivo MTtabaco. gbk que contiene el genoma mitocondrial de tabaco extraer el gen que pida el usuario con 1000 nts upstream y 1000 nts downstream y guardarlo en formato fasta. Especificaciones del formato Genbank. http: //www. ebi. ac. uk/embl/Documentation/FT_d efinitions/feature_table. html Especificaciones del formato Fasta. http: //www. bioperl. org/wiki/FASTA_sequence_f ormat

LOCUS BA 000042 430597 bp DNA circular PLN 02 -MAY-2006 DEFINITION Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete genome. ACCESSION BA 000042 AP 006340 AP 006341 VERSION BA 000042. 1 GI: 56806513 KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Nicotiana tabacum (common tobacco) ORGANISM Nicotiana tabacum Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; lamiids; Solanales; Solanaceae; Nicotianoideae; Nicotiana. REFERENCE 1 AUTHORS Sugiyama, Y. , Watase, Y. , Nagase, M. , Makita, N. , Yagura, S. , Hirai, A. and Sugiura, M. TITLE The complete nucleotide sequence and multipartite organization of the tobacco mitochondrial genome: comparative analysis of mitochondrial genomes in higher plants JOURNAL Mol. Genet. Genomics 272 (6), 603 -615 (2005) PUBMED 15583938 REFERENCE 2 (bases 1 to 430597) AUTHORS Sugiyama, Y. , Watase, Y. and Nagase, M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04 -APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University, Center for Gene Research; Chikusa-ku, Furo-cho, Nagoya, Aichi 464 -8602, Japan (E-mail: ysugiya@gene. nagoya-u. ac. jp, Tel: 81 -52 -789 -5943, Fax: 81 -52 -789 -4526) FEATURES Location/Qualifiers

/db_xref="GI: 56806523" /translation="MDLYSIRNQRISPQKREEFPLLSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVSCSLSCA LN gene CDS LE TKLGQRCEGL" complement(24579. . 25766) /gene="atp 6" Formato Genbank complement(24579. . 25766) /gene="atp 6" /note="CDS is reported in Acc# X 06595" /codon_start=1 /product="ATP synthase F 0 subunit 6" /protein_id="BAD 83425. 1" /db_xref="GI: 56806524" /translation="MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLKSSDTQGSS SGIFTDHPGLNPCSERIVELQYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAF YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLIPMKIGNLYFSFTNPSLF M KFS MN gene LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLSGNVKQ PRISVTFTFSLFCNPQGMIPYSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAGHSSVKILSGFAWTMLC DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQSASFFIIEQ KRV" complement(31411. . 31743)

ORIGIN 1 attcacagtg ctcttcgcaa tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc 61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg gcaactacac cgtcgactcc 121 acaagaactc caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctc cgatcttgtc 181 ccatctcggc ttccacgcgc gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg 241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt tataacacag agtcagcgcg 301 aagaaaggca gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga ttttcatttc 361 tagttagagg agcagaccac tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc 421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc tccaactcgt actttgctac 481 aacgatcttt gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat agggcaattc 541 gtaatgctct cttcctgtcc tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc 601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt tgcatccttg tctggcagtt 661 agctaagcga gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctctactagt 721 cctagtacta gatactagat agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct 781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag tcatatgcgg aacacatgca 841 agtccagatt gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa Formato Fasta >gi|142864|gb|M 10040. 1|BACDNAE B. subtilis dna. E gene encoding DNA primase, complete cds GTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAATTGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGC AGATATCGTTGAAGTCATAGGTGATTATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGT CCTTTTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATTTTTCATTGCTTTGGCT GCGGAGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAAGGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTC TCACCTTGCTGACAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCCGGCCAGAG TCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCTGAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAA ATACAAAAGAAGGTCAAGAGGCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGA ATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTCCTTGTAAAGAGGGGATTTAGT GAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCCTGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCA GAAACCGTGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAGGGCTCTTGG

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Las técnicas más importantes: - Clivado del ADN en sitios específicos por enzimas de restricción. - Hibridación de ácidos nucléicos. Southern blot, Northern blot, hibridación in situ y Western blot. - Clonado molecular del ADN. Vectores de clonado. - PCR, reacción en cadena de la polimerasa.

MANIPULACIÓN DEL ADN IN VITRO ENZIMAS DE RESTRICCIÓN - Permiten realizar cortes en sitios específicos en el ADN, que permiten aislar y manipular genes individuales. - Son endonucleasas (cortan enlaces internos de la molécula) de origen bacteriano. - Reconocen secuencias específicas de ADN de diferente longitud. - Luego del reconocimiento realizan el corte.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN - Existen alrededor de 4000 enzimas de restricción conocidas. - 671 disponibles comercialmente. - Hay bases de datos de enzimas de restricción y sus sitios de reconocimiento y corte: REBASE http: //rebase. neb. com/rebase. html

RESTRICCIÓN EN 2 PASOS from Bio import Restriction from Bio import Seq from Bio. Alphabet import IUPAC an=Restriction. Analysis(Restriction. Comm. Only, Seq (secuencia, IUPAC. unambiguous_dna)) an. print_as ("map") Resultado (output): 7 Tsp. EI Sse 9 I Tsp 509 I Fok. I | | 12 Hpy. CH 4 V Cvi. RI | | 20 Bst. F 5 I Bse. GI | | | ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG |||||||||||||| TACCCATTAACGTTGCCCCGTAGGTTC 1 27

HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS - El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para formar una doble hélice se llama hibridación, dado que puede utilizarse para formar ADN híbrido compuesto por cadenas de diferentes orígenes. - La hibridación permite la formación de complejos DNA: DNA y ADN: ARN usando la complementariedad de bases (A-T, C-G). - El fenómeno de hibridación ocurre bajo condiciones especiales en solución (p. H, concentración de sales, T 0, etc). 5'- A T G C T A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3' 5'- A T G C T A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T C C C G A T T G C A T -3'

TÉCNICAS BÁSICAS DNA Cortado por enzimas de restricción RNA PROTEÍNA ELECTROFORESIS TRANSFERENCIA REVELADO Tranferencia de proteínas, RNA o DNA separados por electroforesis a membranas sintéticas. Hibridación del DNA o RNA con secuencias marcadas con radiactivo (“sondas”). Revelado por radioautografía. Detección de Proteínas con anticuerpos marcados. RESULTADOS Southern blot Northern blot Western blot

HIBRIDACIÓN IN SITU

CLONADO MOLECULAR Introducción en una célula húesped de una mólecula de ADN capaz de replicarse en paralelo con el genoma del húesped en estado episomal, es decir sin integrarse al genoma.

VECTORES DE CLONADO BACTERIÓFAGO O “FAGO” PLÁSMIDOS

PCR

TM temperature melting DNApol de bacterias termofilas Diseño de primers 15 -30 nts

MUESTRAS

USOS DE LA PCR Huella genética Test de Paternidad Diagnóstico de enfermedades hereditarias Clonación de genes Mutagénesis Análisis de ADN fósil Genotipado de mutaciones específicas Identificación de especies

SECUENCIACION A partir de 1970 fue posible determinar secuencia nucleotídica de fragmentos de DNA Métodos clásicos: químico y enzimático Método químico de Maxam y Gilbert Pero en la actualidad los métodos de secuenciación utilizados se basan en el Método enzimático de Sanger

Ventajas - Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia de un técnico que cargue las muestras. - Rapidez en el análisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares, por lo que pueden leerse del orden de 450 nucleótidos en el plazo de 1 hora. Otros métodos de secuenciación automática: - Empleando microarray - Pirosecuenciación

Lectura de unas 100 millones de bases por corrida del instrumento (7. 5 horas).

Referencias Molecular Biology of The Cell. http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/books http: //www. gbiosciences. com/Image/BE 307. jpg http: //www. biologyreference. com/images/biol_02_img 0140. jpg www. biopython. org http: //biology. clc. uc. edu/fankhauser/Labs/Genetics/PCR_Protocol. htm http: //members. aol. com/Bear. Flag 45/Biology 1 A/Lecture. Notes/LNPics/Recomb/pcr. gif Introducción a la Oncología Molecular. Goméz y Alonso. Universidad Nacional de Quilmes, 1998. http: //www. genomesonline. org/gold_statistics. htm Lic. Virginia González