BIOTECNOLOGA INGENIERA GENTICA Biotecnologa Conjunto de tcnicas que

BIOTECNOLOGÍA INGENIERÍA GENÉTICA

Biotecnología: Conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas, hormonas, antibióticos …. ), para la obtención de productos, bienes y servicios Biotecnología tradicional: procesos de fermentación de bacterias y levaduras desde hace miles de años Biotecnología contemporánea Clonación, nanotecnología, biomateriales, reprogramación Biotecnología moderna: en los últimos 30 años, avances en microbiología, inmunología e ingeniería genética, con manipulación selectiva y programada de material genético

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA ROJA - Aplicaciones médicas • Obtención de nuevos productos y fármacos por organismos • Producción de Ac monoclonales • Desarrollo de terapias génicas y celulares VERDE – Aplicaciones agrícolas y ganaderas • Desarrollo de cereales resistentes a plagas • Desarrollo de animales resistentes a enfermedades • Desarrollo de plantas que expresen pesticidas AZUL – Aplicaciones acuáticas y marinas • Uso de plantas y productos marinos para obtener nuevos fármacos • Restauración y preservación de especies acuáticas • Uso de genes de organismos acuáticos para obtener resistencias BLANCA – Aplicaciones a procesos industriales • Producción de nuevos compuestos • Desarrollo de combustibles nuevos • Uso de bacterias para eliminar vertidos de petróleo

ORGANISMOS TRANSGÉNICOS Organismo transgénico: es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gen exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente. Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y descomponer al DNA, intercambiando así fragmentos específicos de ADN de distintas especies e incluso transferirlos a bacterias. Se descubrió posteriormente que esta práctica se venía haciendo en la naturaleza de forma espontánea desde hace millones de años en los vegetales a través de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens. Las bacterias producen hoy en día, proteínas humanas por ingeniería genética como el interferón, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran importancia en la medicina.

ORGANISMOS TRANSGÉNICOS Microorganismos transgénicos Producción de alimentos Eliminación de basuras Obtención de materias primas para la industria Descontaminar lo que las industrias han contaminado Animales de granja (cerdos, ovejas, borregos) "biorreactores“ de proteínas terapéuticas humanas en su leche (antitripsina, factor VIII de coagulación…) Plantas transgénicas "nueva revolución verde“ Resistentes a sequías, a herbicidas o a plagas de insectos, Maduración tardía o con características para mantener el color y sabor después de congelación Ejemplos : algodón, la soja, la papa, el tomate y al maíz

INGENIERÍA GENÉTICA La Ingeniería Genética Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo que carece de ellos Se realiza por Incluye Enzimas de restricción Capaces de cortar el ADN por puntos concretos Técnicas biotecnológicas Se obtiene • Recombinación de ADN • Secuenciación del ADN • Reacción en cadena de la polimerasa • Aplicaciones diversas ADN Recombinante Segmento de ADN extraño intercalado en un ADN receptor

Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética Entre los años 70 y 80 se desarrollaron herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética, lo que se conoce como técnicas del ADN recombinante La técnica se fundamenta en: • Doble cadena del ADN • Complementareidad de bases • Siempre que se encuentren secuencias complementarias se unen • Orden de las bases determina información de proteínas • Código de transcripción universal

Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética La tecnología del ADN recombinante incluye diferentes técnicas de las que destacan: • La rotura específica del ADN mediante endonucleasas de restricción, que facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales. • La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica. • La hibridación de los ácidos nucléicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucléicos. • La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas. • La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a células u organismos.

Enzimas: Endonucleasas de restricción Endonucleasas de Restricción: Enzimas que pueden cortar el ADN y lo hacen en secuencias concretas Enzimas que las bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacteriófagos

Enzimas: Endonucleasas de restricción Se conocen mas de 1200 enzimas de restricción Eco RI (E. coli) reconoce secuencias GAATTC y corta entre G y A

Construcción de ADN recombinante 1 ADN plásmido 2 ADN extraño 3 Corte del plásmido y ADN extraño con Eco RI (endonucleasa de restricción) 4 Formación de extremos cohesivos 5 Formación de ADN recombinantes 6 Acción de ADN ligasa que sella los extremos

Construcción de ADN recombinante

Clonación del ADN La clonación de un gen consiste en introducirlo en una célula de modo que se copie y se mantenga El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonación (plásmidos), capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una célula huésped Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen insertado en la célula hospedadora adecuada apropiada Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un organismo Un plásmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plásmido

Clonación del ADN Proceso de clonación de un gen en bacterias 1. Obtención de plásmido recombinante 2. Transformación de bacterias 3. Selección de bacterias transformadas 4. Crecimiento de bacterias transformadas 5. Aislamiento de los plásmidos recombinantes

Clonación del ADN Prácticas de ejercicios similares en la página indicada Ejercicios: http: //personales. ya. com/geopal/biologia_2 b /unidades/ejercicios/act 8 abiointema 6. htm

Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que permite amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Es un método alternativo a la clonación muy rápido y eficaz Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna Aplicaciones médicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnóstico: Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas. Diagnóstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, o reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas

Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalización". Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de oligonucleótidos (inicidores o primers) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Los “primers” son sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar Tercer paso: la ADN polimerasa produce la “extensión” de los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde (la Tª la condiciona la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) ADN polimerasa de E. coli se desactiva a la alta temperatura de la desnaturalización del ADN, por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus http: //www. youtube. com/watch? v=N 6 k. Bo_p. TOA 8

Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) APLICACIÓN: amplificar ADN • Fragmentos de ADN antiguos (momias, fósiles. . ) • ADN de la escena de un crimen • ADN de células embrionarias para diagnóstico prenatal • ADN de genes virales

SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Sanger • Métodos y técnicas para determinar el orden de los nucleótidos de un determinado fragmento de ADN • Utilidad importante en biología básica y aplicada (forense…) • Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonación) Método Sanger o didesoxi: • Fragmento de ADN (cantidad) • Cebador en el extremo 3´ (20 bases) • ADN polimerasa • Desoxiribonucleótidos (A, T, C, G) • Didesoxiribonucleótidos marcados radiactivamente (paran la síntesis) Cuatro tubos diferentes con: ØPolimerasa Ød. ATP, d. CTP, d. TTP y d. GTP ØUn solo didesoxi marcado (dd. ATP) ØSe forman fragmentos de distinto tamaño terminados en A

SECUENCIACIÓN DEL ADN Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaños con electroforesis Cada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gel Terminada la electroforesis se ponen en contacto con una película fotográfica

SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Automático Marcaje de dd. NTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo tiempo los. ADNs de las cuatro mezclas Comparativa de los dos métodos

INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente • Tradicionalmente se han mejorado los cultivos por selección de ejemplares • Actualmente se mejoran características con técnicas de ADN recombinante: -Plantas transgénicas- El plásmido Ti o T-ADN de Agrobacterium contiene genes (onc) que provocan una mayor producción de hormonas de crecimiento con la formación del tumor o agalla. Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habrá obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la planta, evitando la aparición de la enfermedad

INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente Actualmente se consiguen mejorar diferentes características con técnicas de ADN recombinante -Plantas transgénicas- • Resistencia a herbicidas (mejora vegetal) • Resistencia al glifosfato herbicida no selectivo, con gen de E. coli resistente, clonado e incorporado • Resistencia a plagas, con toxina de Bacillus turingiensis • Resistencia a virus, con proteínas de la cápsida de dicho virus FASES: 1. Transferencia de genes 2. Regeneración de plantas completas

INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente • Mejora del producto (alimentos) • Arroz transgénico –arroz dorado- con βcaroteno (vit A) • Plantas farmaceúticas (biofarmaceútica) • Producción de proteínas humanas, vacunas, anticuerpos, mas económicas y contienen mecanismos de modificación postraduccional de las proteínas, a diferencia de las bacterias

INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente • Medio Ambiente: Utilización de organismos genéticamente modificados para eliminar contaminantes Biorremedación: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos Bioadsorción: Bacterias modificadas que adsorben en su superficie metales pesados

INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente Fitorremedación: Plantas transgénicas que transforman contaminantes peligrosos en sustancias inocuas chopos modificados para acumular metales, actualmente en condiciones controladas en invernadero La fitoestabilización : plantas que inmovilizan los metales en el suelo por absorción o adsorción en las raíces. Los contaminantes permanecen retenidos bajo la superficie del suelo La fitoextracción : plantas tolerantes capaces de absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su biomasa aérea. Posteriormente, esta biomasa es cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso

INGENIERÍA GENÉTICA y GANADERÍA • Inserción de genes en óvulos o células madre embrionarias: Quimeras transgénicas sólo sobre algunas células del embrión Células modificadas Células no modificadas Organismos transgénicos todas las células modificadas Transmisión a la descendencia, órganos y tejidos para trasplantes 1. Secuencia hibrida de gen de interés y secuencia promotora de una proteína de la leche 2. Introducir el transgén en óvulo fecundado 3. Implantación en la hembra que lo expresará junto con la leche Ejs. : α 1 -antitripsina, factor VIII, …

INGENIERÍA GENÉTICA y MEDICINA APLICACIONES Obtención de productos farmacéuticos Insulina Interferón H. De crecimiento Factor VIII Medicina forense Marcadores genéticos Huella genética Terapia génica Diagnóstico de enfermedades Detección en personas o fetos enfermedades hereditarias por técnicas de ADN recombinante Inserción de genes funcionales para corregir un defecto genético En células germinales En células somáticas

Producción de insulina humana La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados. Promotor Subunidad A del gen de la insulina Promotor Subunidad B del gen de la insulina Proteína de fusión con subunidad A del gen de la insulina Transformación en E. coli Extracción de Separación de las proteínas de los polipéptidos fusión Ay. B Proteína de fusión con subunidad B del gen de la insulina Formación de insulina activa

CONSTRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE