Microscopa y tcnica histolgica Unidad de medida Valos

Microscopía y técnica histológica

Unidad de medida Valos de la unidad Milímetros (mm) 10 -3 Micrómetro (µm) 10 -6 m m Nanómetro (nm) 10 -9 m Amstrong (Å) 10 -10 m Método de estudio Estructura visualizada Ojo Órganos, Tejidos, Lupa Células grandes Microscopías ópticas Tejidos, Células Organoides grandes Microscopía Electrónica Componentes subcelulares Microscopía de Polarización Virus Macromoléculas Microscopía Electrónica Estructura Moléculas 1 mm = 1. 000 µm = 1. 000 nm = 10. 000 Å

Microscopio “Es un instrumento que sirve para visualizar diversas estructuras que escapan al límite de resolución del ojo humano a través del aumento de los objetos observados” SIMPLES Una sola lente COMPUESTOS Sistemas ópticos centrados FOTÓNICOS ELECTRÓNICOS • Lupa • Microscopio Óptico • Microscopio de Campo Oscuro • Microscopio de Fluorescencia • Microscopio de Polarización • Microscopio de Contraste de Fases • Microscopio de Interferencia • Microscopio de Luz UV • M. E. T. • M. E. B.

MICROSCOPIO ÓPTICO Parte Mecánica • Pie • Columna - Tornillo micro y macrométrico • Tubo - Soporta ocular y revolver • Platina • Subplatina - Da soporte al aparato de iluminación Parte Óptica • Aparato de Iluminación - Condensador - Espejo - Diafragma Iris • Objetivo • Ocular

Formación de la imagen IMAGEN FINAL: VIRTUAL, MAYOR e INVERTIDA

Ø Objetivos CLASIFICACIÓN: Ø Objetivos secos: el aire se interpone directamente entre el objeto y el objetivo. Según el aumento: - Seco débil (10 X); - Seco fuerte (40 X) Ø Objetivos de inmersión: entre el objeto y el objetivo se interpone un líquido de índice de refracción superior al aire (agua, aceite de cedro, etc. ) 4 X 100 X 40 X

APERTURA NUMÉRICA: es la cantidad de rayos luminosos emergentes del preparado que son captados por el objetivo A. N. = A. N. N. Sen α Índice de refracción del medio interpuesto. Seno del semiángulo de apertura (valor máximo = 0, 1) Ej. : Aire: 1 Vidrios: 1, 52 Agua: 1, 33 Aceite: 1, 51 Semiángulo de Apertura: Es el semiángulo formado por los rayos mas periféricos, que partiendo de la fuente luminosa penetran en el objetivo

PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de un sistema óptico para mostrar separados puntos situados a muy pequeña distancia entre sí. 1 PR = LR = 0, 61 X λ AN Longitud de onda de la luz empleada Ej. : Blanca: 5550 Å UV: 2500 Å Electrón: 0, 056 Å LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la distancia mínima que separa dos puntos para poder discriminarlos como tales

Resolución del ojo en comparación con microscopios Distancia entre los puntos que se resuelven Ojo humano 0, 2 mm M. O. de campo claro 0, 2 µm MEB nm 2, 5 MET En Teoría nm En Práctica Microscopía de fuerza atómica 0, 05 1, 0 nm 50 pm

“Cuanto menor sea el LR de un microscopio, nos dará mejores datos sobre la estructura del objeto queremos observar” El LR puede disminuir: • λ : Utilizando luz UV • AN : Cambiando el medio interpuesto entre el objeto y el objetivo Con Aceite de cedro: A. N. = A. N. N. Sen α A. N. LR = AN LR Utilizando Luz UV: λ 0, 61 X λ LR = 0, 61 X λ AN

Ø Ocular Tiene como función aumentar la imagen dada por el objetivo, actúa igual a una lupa. PARA CALCULAR EL AUMENTO TOTAL, MULTIPLICAMOS EL AUMENTO DEL OBJETIVO POR EL DEL OCULAR Ej. : 45 X 10 = 450 X

M. O. M. E. Luz solar o artificial Filamentos de Tungsteno Al aire Al vacío Ocular-Objetivo. Condensador Bobinas electromagnéticas Ojo- cámara fotográfica Pantalla Fluoroscópica o placa fotográfica MONTAJE Vidrio (portaobjetos) Grilla de cobre CÉLULAS Vivas o muertas Muertas Color o B/N AUMENTO TOTAL 100 X-450 X-1000 X-2000 X 1. 000 X MECANISMO DE FORMACIÓN DE L AIMAGEN Absorción desigual de la luz por el preparado Dispersión de electrones Estructural Ultraestructural FUENTE DE ENERGÍA TUBO LENTES CAPTACIÓN DE LA IMAGEN NIVEL DE ESTUDIO

M. E. T. Electromicrografía correspondiente a un macrófago. Se puede observar la presencia de prolongaciones citoplasmáticas abundantes (flechas) y un centríolo (C) en la parte central, rodeado por vesículas del complejo de Golgi (G). En el citoplasma aparecen dispersos numerosos lisosomas secundarios (L). 15. 000 X.

M. E. B. Electromicrografía de barrido de eritrocitos humanos normales. Obsérvese la forma bicóncava de estos corpúsculos. 6. 500 X.

Técnica histológica Ø Se basa en un conjunto de procedimientos que nos permiten estudiar y ver los tejidos y las células con mayor claridad cuando estamos frente el microscopio óptico. Ø Este conjunto de procedimientos se puede realizar mediante la manipulación de tejidos vivos o de tejidos muertos.

Preparación de tejidos muertos Ø Obtención de la muestra (biopsia o necropsia). Ø Fijación: El objetivo de la fijación es detener los procesos celulares dinámicos con la mayor rapidez posible y mantener la estructura con las mínimas modificaciones posibles. Químicos: Formol – glutaraldehido – tetróxido de osmio. Físicos: Desecación – calor seco – frío.

Ø Inclusión: - deshidratación (con alcohol). - aclaración (con xilol). - inclusión propiamente dicha (parafina). Ø Corte: De 5 a 15 micrones con micrótomo. Ø Coloración: Se coloca el preparado en un portaobjetos. - Se hidrata con pasos contrarios a inclusión. - Se colorea con hematoxilina y eosina. Ø Montaje final: Se coloca cubreobjetos con pegamento.

Métodos Histoquímicos Ø Mediante la histoquímica podremos obtener la localización de estructuras a nivel celular y se basa en utilizar distintas sustancias que tendrán una afinidad específica para la estructura queramos localizar. Ø Hematoxilina y Eosina: - Componentes basófilos: ADN (cromatina o cromo- soma), ARN (nucléolo y REG) y cartílago (por GAGs). - Componentes acidófilos: el citoplasma celular (por las proteínas) y las mitocondrias (proteínas en la MMI).

Ø Metacromasia: Este fenómeno sucede cuando en un tejido se encuentran muchas caras negativas muy cercanas entre sí, esto hace que ciertos colorantes básicos (azul de toluidina) se agrupen formando polímeros y de esta manera cambia el espectro de absorción de la luz cambiando la coloración azul por una púrpura o roja. - Cartílago - Gránulos de mastocitos - Nucleoproteínas

Ø Reacción de P. A. S: La sigla P. A. S. representa la reacción del ácido peryódico de Schiff, y mediante esta técnica podremos poner al descubierto hidratos de carbono (glucógeno), glucoproteínas, fibras reticulares, membranas basales y GAGs.

Ø Reacción de Feulgen: técnica es específica para el ADN, ya que la reacción se da con la desoxirribosa que se encuentra sólo en esta macromolécula. Ø Radioautografía: la técnica se basa en utilizar una marca radiactiva que podrá ser ubicada en cualquier tejido en el cual se encuentre, esta marca radiactiva está representada por un isótopo radiactivo (con diferente número de neutrones).

Ø Coloración de grasas: Se usan sustancias colorea- das y solubles en grasa que se disuelven en lípidos. -Los colorantes más utilizados se denominan sudanes y hay varios tipos, el sudán rojo tiñe a los triacilgliceroles de los adipocitos, el sudán negro se usa para teñir las vainas de mielina de las fibras nerviosas, otros Sudanes son el black y el amarillo, también se utiliza el aceite rojo O (no es un sudán). -Es importante aclarar que cuando queramos ver lípidos fijemos las muestras en formol y luego se realicen cortes por congelación,

Ø Inmunomarcación: Esta técnica se basa en la especificidad de la unión de un antígeno con un anticuerpo, un antígeno es una sustancia que puede ser reconocida como extraña y un anticuerpo es una inmunoglobulina (proteína) que reconoce al antígeno (sustancia extraña). - Se puede realizar inmunomarcación de tejidos y se denomina inmunohistoquímica, esta se realiza en los cortes de la técnica histológica, mientras que la inmunomarcación de las células se denomina inmunocitoquímica.