Fondamenti di elettroforesi capillare Hardware CREIAMO UNA SCIENZA

Fondamenti di elettroforesi 
 capillare: Hardware CREIAMO UNA SCIENZA MIGLIORE TU E AGILENT Esclusivamente per la didattica November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 1

Nel quadro del proprio impegno nei confronti del mondo accademico, Agilent Technologies consente l'accesso ai contenuti di proprietà dell'azienda qui presentati. 
 Questa serie di diapositive è stata creata da Agilent Technologies. Le diapositive possono essere utilizzate esclusivamente per l'insegnamento. Questi contenuti e le informazioni qui presentate sono accettati “così come sono”; Agilent non offre dichiarazioni o garanzie di alcun tipo riguardo ai contenuti e declina ogni responsabilità riguardo a essi nella forma in cui possano essere utilizzati o riprodotti da chi legge. Agilent non è responsabile per nessun danno risultante o connesso con riferimento all'uso, alla riproduzione o alla divulgazione, da parte di chi legge, dei contenuti qui presentati. Chi legge acconsente a risarcire e manlevare Agilent per qualsiasi rivendicazione subita in conseguenza dell'uso o della riproduzione di tali contenuti da parte di chi legge. Qualora immagini, schizzi o disegni debbano essere utilizzati per altri scopi, contattare anticipatamente Agilent Technologies. Esclusivamente per la didattica November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 2

Sommario Introduzione • Definizione e cenni storici • Campi di applicazione della CE • La versatilità della CE • Che aspetto ha un elettroferogramma? Strumentazione • Componenti di un sistema CE • Introduzione del campione • Autocampionatore • Capillare e cassetta • Rivelazione • Sistema di rifornimento • Esempi Ulteriori informazioni Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 3

Introduzione Definizione e cenni storici L'elettroforesi è stata definita come la migrazione differenziale di specie cariche (ioni) per effetto dell'attrazione o della repulsione in un campo elettrico. L'elettroforesi come tecnica di separazione è stata introdotta da Arne Tiselius (Svezia, 1902 -1971) nel 1937. Collocando delle miscele di proteine in soluzioni tampone in un tubo e applicando un campo elettrico, egli scoprì che i componenti del campione migravano con direzione e velocità determinati dalla loro carica e dalla loro mobilità. Per il suo lavoro nel campo della separazione Tiselius ricevette il Premio Nobel per la chimica (1948). Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 4

Introduzione Campi di applicazione della CE L'elettroforesi capillare (CE) è una tecnica di separazione a scopo qualitativo o quantitativo per la rivelazione di molecole di piccole e grandi dimensioni. È spesso utilizzata in combinazione con la spettrometria di massa. Trova impiego in un ampio range di settori, tra i quali: • analisi di cationi/anioni • composti polari (per es. droghe basiche) • prodotti naturali in matrici complesse • analisi di composti chirali e isomeri • caratterizzazione di proteine (per es. anticorpi) • analisi di peptidi, DNA, RNA, oligonucleotidi • interazioni tra molecole (per es. proteina-DNA) Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 5

Introduzione Campi di applicazione della CE La versatilità dell'elettroforesi capillare deriva dalle sue numerose modalità operative. Modalità operative Eluizione Separazione in base alle differenze di velocità delle zone: • Elettroforesi di zona capillare (CZE) • Cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC) • Elettrocromatografia capillare (CEC) Setaccio molecolare Separazione in base al passaggio attraverso una fase stazionaria o immobile (gel) a seconda della dimensione e della forma: • Elettroforesi capillare gel (CGE) Focalizzazione isoelettrica capillare (CIEF) Separazione mediante il passaggio attraverso un gradiente di p. H stazionario nel tampone di analisi. Isotacoforesi capillare (CITP) Separazione in base a un gradiente di campo elettrico mobile tra un elettrolita di entrata e uno di uscita che fa in modo che tutte le molecole del campione si muovano in zone connesse tra loro che hanno concentrazione costante e la stessa velocità. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 6

Introduzione La versatilità della CE Elettroforesi di zona capillare (CZE) La CZE è la forma più semplice di CE. Nella CZE, un capillare viene riempito con un elettrolita (tampone di analisi), il campione viene introdotto in corrispondenza dell'iniettore, quindi viene applicato un campo elettrico. Cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC) La MECK (tecnica ibrida di elettroforesi e cromatografia) è una modalità CE ampiamente utilizzata per i prodotti biofarmaceutici e le molecole di piccole dimensioni. È l'unica tecnica elettroforetica che è possibile utilizzare per la separazione di soluti sia neutri che carichi. Elettrocromatografia capillare (CEC) La CEC è un tipo di cromatografia liquida miniaturizzata che utilizza un campo elettrico per pompare un liquido in una colonna di cromatografia impaccata mediante flusso elettrosmotico (EOF), assicurando numeri di piatti molto elevati. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 7

Introduzione La versatilità della CE Elettroforesi capillare gel (CGE) Isotacoforesi capillare (CITP) LA CGE è ideale per la separazione in base alle dimensioni delle macromolecole (proteine, acidi nucleici). Quando i soluti carichi migrano attraversando la rete polimerica, il loro movimento viene ostacolato, quello dei soluti di dimensioni più grandi in modo maggiore rispetto a quello dei soluti di dimensioni più piccole. La separazione di DNA e proteine saturate con SDS (sodio-dodecilsolfato) non può essere effettuata senza un gel a causa dell'invariabilità dei rapporti massa/carica. La CITP è una tecnica di elettroforesi a “barriera mobile” in cui una combinazione di due sistemi tampone viene utilizzata per creare uno stato in cui tutti i soluti si muovono in bande separate ma tra loro connesse e alla stessa velocità. Le zone rimangono separate tra due elettroliti detti di entrata e di uscita. Possono essere analizzati sia i cationi che gli anioni. Focalizzazione isoelettrica capillare (CIEF) La CIEF è una tecnica elettroforetica ad “alta risoluzione” utilizzata per separare peptidi e proteine in base al loro punto isoelettrico (p. I). Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 8

Introduzione Che aspetto ha un elettroferogramma? A differenza di quanto accade con gli slab gel, l'uscita di un'analisi CE è un elettroferogramma. Migrazione differenziale dei soluti sovrapposta al flusso elettrosmotico nella CZE. L'analita cationico (1) ha la mobilità maggiore, seguito dall'analita neutro (n) e dai due analiti anionici (2, 3). Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 9

Strumentazione Componenti di un sistema CE Rivelatore a serie di diodi UV Cassetta per cartuccia Vassoio portacampioni Sistema di rifornimento Pompa per pressione/vuoto Sistema operativo Cartuccia del capillare Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 10

Strumentazione Introduzione del campione Nella CE soltanto volumi di campione molto piccoli (tipicamente 1 - 50 n. L) vengono caricati nel capillare per evitare un sovraccarico di campione. Metodi di iniezione più comuni: • Idrodinamico - Applicazione di una pressione all'estremità di iniezione del capillare e del vuoto all'estremità di uscita - Viene creata una depressione sollevando il serbatoio di iniezione rispetto al serbatoio di uscita • Elettrocinetico (elettromigrazione) - Sostituendo il serbatoio del tampone dell'estremità di iniezione con il vial del campione e applicando una tensione Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 11

Strumentazione Autocampionatore termostatato per vial di campione e di tampone. Ruotando il carosello il vial del campione di interesse viene portato nella posizione di iniezione. Un sensore di vial rileva le posizioni occupate del vassoio. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 12

Strumentazione Capillare e cassetta Rivelatore Il capillare è installato nella cassetta che è inserita nel sistema, esattamente di fronte al rivelatore. Le estremità del capillare terminano nei vial. Interfaccia di allineamento con finestra di rivelazione ad allineamento automatico Capillare avvolto Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 13

Strumentazione Capillare A seconda dell'applicazione, sono disponibili differenti capillari. Caratteristiche Con rivestimento in CEP I capillari in CEP contengono un rivestimento polimerico legato in modo permanente. • Prevenzione dall'assorbimento del campione • Eliminazione dell'EOF (quasi) • Raccomandato per la separazione del DNA e per l'analisi di anioni e acidi organici Con rivestimento in PVA I capillari con rivestimento in PVA contengono uno strato assorbito in modo permanente di alcol polivinilico. • Riduzione dell'interazione idrofobica ed elettrostatica soluto/parete • Eliminazione dell'EOF • Raccomandato per l'analisi di proteine e ammine µSIL-DB µSIL-WAX µSIL-FC I capillari µSIL sono rivestiti in modo permanente utilizzando processi di reticolazione brevettati per mascherare gruppi di silanolo attivi e fornire un'elevata stabilità. • EOF ridotto, per la modalità c. IEF • Raccomandato per la separazione di biomolecole come frammenti di PCR, proteine, peptidi e carboidrati Silice fusa non rivestita Capillare per CE standard senza rivestimento interno. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 14

Strumentazione Rivelatore a serie di diodi UV-Vis (190 -600 nm) Lampada al deuterio Il rivelatore è a temperatura controllata Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 15

Strumentazione Rivelazione UV-VIS L'assorbimento UV-visibile è il sistema di rivelazione più ampiamente utilizzato per via della sua universalità e del fatto che si tratta di un sistema di rivelazione a capillare. L'assorbanza è correlata alla concentrazione secondo la legge di Beer-Bouguer-Lambert: Cammino ottico Capillare e coefficiente di estinzione o assorbimento molare (Lmol-1 cm-1) b lunghezza del percorso (cm) c concentrazione Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 16 Allineamento Ferrula La brevità della lunghezza del percorso (b) è il principale fattore limitante della sensibilità nella CE. Sono disponibili celle di flusso progettate con lunghezza del percorso estesa (cella a bolla e cella a Z, vedere l'immagine).

Strumentazione Rivelazione spettroscopica: assorbimento ultravioletto (UV) • Un fascio luminoso ultravioletto viene inviato attraverso una cella di flusso e un sensore misura la luce che attraversa la cella. • Se un composto che eluisce dal capillare assorbe tale energia luminosa, ha luogo una variazione della quantità di energia luminosa che colpisce il sensore. • La variazione risultante nel segnale elettrico viene amplificata ed inviata ad un registratore o sistema di gestione dei dati. • Talvolta si ottiene anche uno spettro ultravioletto, che può essere di ausilio nell'identificazione di un composto o di una serie di composti. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 17 Schema di un rivelatore a serie di diodi (DAD) • Altre opzioni: - Rivelatore a selezione di massa (MSD) - Rivelatore a fluorescenza indotta da laser (LIF) - Rivelatore a conducibilità senza contatto (CCD) vedere le note per i dettagli

Strumentazione Sistema di rifornimento Il rifornimento del tampone è fondamentale per mantenere un'elevata riproducibilità del tempo di migrazione. L'elettrolisi della soluzione può alterare il p. H del tampone di analisi e di conseguenza modificare l'EOF. Il sistema di rifornimento (serbatoio del tampone) è situato al di sotto del carosello del campione. Riproducibilità del tempo di migrazione migliorata utilizzando il rifornimento del tampone. Sovrapposizione dei cicli di analisi 5, 10 e 15. A) rifornimento ogni 5 cicli. B) nessun rifornimento. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 18

Esempio Profilo completo di estrogeni liberi e coniugati Elettroferogrammi degli ioni estratti che mostrano la risoluzione di 10 μM di estrogeni coniugati aggiunti e 20 μM di estrogeni liberi a p. H 9, 5. I glucuronide coniugati sono perfettamente risolti rispetto ai solfato coniugati, inclusi i principali isomeri strutturali, precisamente E 23 G ed E 217 G (m/z 447, 2024) e E 33 G ed E 316 G (m/z 463, 1974). Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 19 Spettro TOF/MS e rapporti isotopici previsti (riquadri rossi) sulla base della formula empirica per l'estradiolo 17 -glucuronide. Fonte: Comprehensive Profiling of Free and Conjugated Estrogens by Capillary Electrophoresis-Time of Flight-Mass Spectrometry

Esempio Analisi di eterogeneità della carica di anticorpi monoclonali Gruppo isoforma p. I apparente Area del picco (%) Media SD RSD% A 6, 546 0, 007 0, 105 4, 29 0, 47 10, 93 B 6, 457 0, 004 0, 056 23, 22 0, 58 2, 50 C 6, 365 0, 003 0, 042 32, 94 0, 69 2, 08 D 6, 290 0, 002 0, 036 25, 66 1, 48 5, 77 E 6, 232 0, 002 0, 029 13, 89 1, 76 12, 67 Precisione intermedia per c. IEF ad alta risoluzione sul sistema CE Agilent 7100. I dati sono stati ottenuti su quattro strumenti CE con sei cicli di analisi per strumento in quattro giorni differenti (n=24). Quantificazione di isoforme di anticorpi monoclonali Ab. Una parte di un elettroferogramma della Figura 1 è stata ingrandita per mostrare l'associazione dei picchi mlg. G 1 a 5 gruppi di isoforme A-E come indicato. Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 20 Fonte: Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing on the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System

Esempio Analisi di ammine biogeniche in salmone e gamberetti Ammina biogenica y= a ± bx R 2 LOD (ng/m. L) LOQ (ng/m. L) SPM y= 0, 0056 ± 0, 1177 x 0, 999 1, 9 6, 3 SPD y= 0, 0144 ± 0, 1927 x 0, 999 2, 6 8, 6 PUT y= 0, 0112 ± 0, 0826 x 0, 999 2, 5 8, 3 HIS y= 0, 0330 ± 0, 2254 x 0, 999 1, 1 3, 6 CAD y= 0, 164 ± 0, 1503 x 0, 999 1, 6 5, 3 Parametri importanti del metodo per la determinazione delle ammine biogeniche proposto; per la tabella completa, consultare la nota applicativa. Elettroferogramma CE-MS/MS di una miscela di ammine biogeniche, ognuna alla concentrazione di 10 μg/m. L, in un elettrolita di fondo. Spermina (SPM), spermidina (SPD), putrescina (PUT), istamina (HIS), cadaverina (CAD), agmatina (AGM), 1, 7 diamminoeptano (DIA) a 5 μg/m. L (standard interno), feniletilamina (PHE), tiramina (TYR), triptamina (TRY), acido urocanico (URO), serotonina (SER). Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 21 Fonte: Analyze Biogenic Amines in Salmon and Shrimp by Capillary Electrophoresis-Tandem MS

Ulteriori informazioni sui prodotti Agilent sono disponibili agli indirizzi www. agilent. com e www. agilent. com/chem/academia Domande o suggerimenti su questa presentazione? Inviare un messaggio e-mail all'indirizzo academia. team@agilent. com Pubblicazione Titolo Codice pub. Brochure Soluzioni di CE e CE/MS Agilent 5989 -1511 EN Manuale per l'utilizzatore Sistema per Elettroforesi Capillare Agilent serie 7100 G 7100 -9000 Nota applicativa Comprehensive Profiling of Free and Conjugated Estrogens by Capillary Electrophoresis-Time of Flight-Mass Spectrometry 5990 -9669 EN Nota applicativa Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing on the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System 5991 -1141 EN Nota applicativa Analyze Biogenic Amines in Salmon and Shrimp by Capillary Electrophoresis-Tandem MS 5991 -6255 EN Web Elettroforesi capillare e CE/MS Web CHROMacademy: accesso gratuito ai corsi online per studenti e personale universitario Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 22

GRAZIE Sommario Esclusivamente per la didattica November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 23

Abbreviazioni Abbreviazion e Definizione Abbreviazio ne Definizione b Lunghezza del percorso MEKC Cromatografia elettrocinetica micellare c Concentrazione MS Spettrometria di massa CE Elettroforesi capillare n. L Nanolitro CEC Elettrocromatografia capillare PVA Alcol polivinilico CEP Polimero di polietilene reticolato TOF Time-of-Flight (spettrometria di massa) CGE Elettroforesi capillare gel CIEF Focalizzazione isoelettrica capillare CZE Elettroforesi di zona capillare CITP Isotacoforesi capillare EOF Flusso elettrosmotico (elettroendosmotico) e Coefficiente di estinzione o assorbimento molare (Lmol-1 cm-1) Sommario Esclusivamente per la didattica Solo per scopi di ricerca. Non utilizzabili per procedure diagnostiche. November 1, 2020 5991 -8064 ITE © Agilent Technologies, Inc. 2016 24