Cellules souches et cellules prolifrantes Rgulation de la

Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre 2010 L. Mauvieux

Concept de la cellule souche • Cellule à longue durée de vie • Capable d’auto-renouvellement (duplication sans perte des capacités de développement) • Pouvant donner naissance à de multiples types cellulaires (différenciation) • Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en cellules originaires normalement des 3 couches embryonnaires: endoderme, mésoderme ectodermes • Capables de Prolifération • De régénérer des tissus après blessure • De plasticité dans ces différentes options

Hierarchie des cellules souches

Epiderme

Jargon des cellules souches Potence définit la capacité à se différencier en différents types cellulaires Pluripotent pouvant donner naissance à tous les types cellulaires adultes Les cellules souches embryonnaires sont pluri-potentes Multipotent pouvant se différencier en de multiples types de cellules spécialisées, mais pas toutes les cellules souches tissulaires (adultes) sont multipotentes

Cellules souches embryonnaires: – 1) Cellules ES • Dérivées du blastocyste en culture • Par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans un œuf énucléé – 2) Cellules somatiques « reprogrammées » • « induced pluripotent stem cells » (i. PS) – TFs, Oct 4, Sox 2, c. Myc and Klf 4 – Sox 2 et Hox 4

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines J 0 J 1 J 5 J 4 blastocyste compaction J 2 J 3

Feeder de fibroblastes murins Colonie de cellules ES

Critères pour caractériser le caractère de cellule souche ( « stemness » ) • Auto-renouvellement: – Potentiel de renouvellement illimité in vitro – Expression de facteurs de transcription caractérisant la cellule souche (nano. G, oct 4, SOX 2, TERT…) • Pluripotence in vitro: – Formation de tératomes dans la souris imunocompétente (potentiel tumoral) – Pluripotence in vitro

Formation de Tératome • Tumeur hétérogène composée de cellules issues des trois feuillets embryonnaires – Ectoderme (peau, poils, dents…) – Mésoderme (os, cartilage, muscle…) – Endoderme (épithélium gastro-intestinal, bronchique…)

Pluripotence des cellules ES in vitro

Cellules souches embryonnaires: – 1) Cellules ES • Dérivées du blastocyste en culture • Par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans un œuf énucléé – 2) Cellules somatiques « reprogrammées » • « induced pluripotent stem cells » (i. PS) – TFs, Oct 4, Sox 2, c. Myc and Klf 4 – Sox 2 et Hox 4

Chez l’homme

Cellules souches « adultes »

Tissus à renouvellement rapide=cellules souches cheveux Moelle osseuse Épithélium digestif

Cellules souches adultes • Les cellules souches adultes sont cruciales pour le renouvellement tissulaire • Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement et de différenciation • L’homéostasie d’un organisme adulte résulte de l’équilibre entre: – l’état quiescent de ces cellules souches (pool de réserve) – et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le renouvellement tissulaire) • Modèle des cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Modèle CSH • Durent toute la vie… • Hématopoïèse • À la base des greffes de moelle allogéniques: thérapie cellulaire de loin la plus utilisée

CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES TRANSFERT ADOPTIF=>GREFFE DE MOELLE Expérience princeps: Till et Mc Culloch, 1961 Irradiation sub-léthale 1000 Gy + Greffe de moelle (IV) J 10: colonies de cellules hématopoïétiques clonales, multi-linéales, dans la rate (CFU-S)

CARACTERISATION DES CSH : reconstitution de l’hématopoïèse à long terme

Traitement par le 5 -fluoro-uracile Anti-métabolite incorporé dans l’ADN et l’ARN Suda et coll, Trends in immunology Vol. 26 August 2005

Tri des cellules par cytomètre en flux • Identification d’une fraction cellulaire capable de reconstituer l’hématopoïèse : contient les cellules souches – Cellules quiescentes – Très rares: ~1/10. 000 cellules – Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-) – Capables d’effluer des colorants (Rhodamine, Hoechst) par des transporteurs ABC: ABSG 2 et MDR 1 – Expriment (CD 34+), CD 133, c-kit

• Dans la M. O , le nombre de CSH reste Caractéristiques des CSH relativement constant en l’absence de perte de sang ou d’autres traumatismes • L’état de quiescence corrèle avec leur caractère multipotent • 2 modèles pour expliquer l’homéostasie de l’hématopoïèse

Modèle A: • Dans des conditions normales, ces CSH sont quiescentes (G 0 du cycle cellulaire), mais se divisent régulièrement, – pour assurer la maintenance du pool de CSH – Permet d’éviter d’acquérir des mutations conduisant à leur transformation maligne – Division asymétrique: • 1 CSH => 1 CSH + 1 cellule qui va s’engager dans la différencation Linheng

Modèle B: – 1 pool de CSH « dormantes » , qui gardent la capacité de d’activité de cellule souche multipotentes – réagissant aux besoins suscités par l’organisme – revenant à l’état dormant une fois les lésions réparées Linheng

Population capable de reconstituer l’hématopoïèse: Différents sous types, plus ou moins en cycle Wilson cell 2008

-Injection de Brd. U dans les souris à un instant donné -Le Brd. U s’intercale dans l’ADN qui devient fluorescent -Suivi du contenu en Brd. U par cytométrie en flux Wilson, Cell décembre 2008

Modèle B: synthèse Linheng

Organisation de la moelle hématopoïétique

Niche ostéoblastique À l’interface os/moelle: Les ostéoblastes: -fabriquent la trame osseuse -supportent le développement des CSH: *Un déficit ostéoblastique entraîne une diminution importante de l’hématopoïèse (Visnjic, 2004) *La co-transplantation de d’ostéoblastes avec les cellules souches augmente la prise de greffe (Tachman, Hematology 2000) Cellules souches Lin- : -marquées à la fluorescéine - Injectée à une souris témoin -analyse 15 h après Localisation des cellules souches au niveau de l’endostéum, au contact des ostéoblastes => Interactions préférentielles Nilsson, S. K. et al. Blood 2001

La niche hématopoiétique « adulte » -contacts physiques-

La niche hématopoiétique « adulte » -contacts physiques-

La niche hématopoiétique « adulte » Ang 1

La niche hématopoiétique « adulte »

La niche hématopoiétique « adulte »

La niche hématopoiétique « adulte » CXCL 12 Noradrénaline CXCL 12 pleraxifor SYSTEME NERVEUX SYMPATHIQUE

« Synapse » ostéoblaste - CSH

Synthèse • Les CSH intègrent des signaux qui proviennent de l’interaction avec: – les ostéoblastes, les cellules réticulaires (mésenchymateuses) – mais aussi du micro-environnement médullaire qui est ouvert notamment en raison de la riche vascularisation de la moelle osseuse – Les cellules en cours de différenciation • comment peut s’opérer la différenciation et l’expansion des cellules hématopoïétiques?

Etapes de la régulation de l’hématopoïèse Quiescence Auto-renouvellement CSH indifférenciée multipotente Engagement Différenciation Maturation Cellules hématopoïétiques différenciées

Hierarchie de l’hématopoïèse

Le système hématopoïétique Cellules souches SCID-RC Reconstitution lympho-myéloïde. in vivo 0, 0001% CD 34+ ≥ (4 mois) 0, 01% Cultures à long terme* in vitro Progéniteurs immatures LTC-IC Progéniteurs déterminés 0, 5 à 1% Formation de colonies* in vitro CFC 99% (5 semaines) (10 -21 jours) Cellules identifiables morphologiquement Myéloïdes Lymphoïdes *: Facteurs de croissance

Le système hématopoïétique Cellules souches SCID-RC Reconstitution lympho-myéloïde. in vivo 0, 0001% CD 34+ ≥ (4 mois) 0, 01% Cultures à long terme* in vitro Progéniteurs immatures LTC-IC Progéniteurs déterminés 0, 5 à 1% Formation de colonies* in vitro CFC 99% (5 semaines) (10 -21 jours) Cellules identifiables morphologiquement Myéloïdes Lymphoïdes *: Facteurs de croissance

Le système hématopoïétique Cellules souches SCID-RC Reconstitution lympho-myéloïde. in vivo 0, 0001% CD 34+ ≥ (4 mois) 0, 01% Cultures à long terme* in vitro Progéniteurs immatures LTC-IC Progéniteurs déterminés 0, 5 à 1% Formation de colonies* in vitro CFC 99% (5 semaines) (10 -21 jours) Cellules identifiables morphologiquement Myéloïdes Lymphoïdes *: Facteurs de croissance

Le système hématopoïétique Cellules souches SCID-RC Reconstitution lympho-myéloïde. in vivo 0, 0001% CD 34+ ≥ (4 mois) 0, 01% Cultures à long terme* in vitro Progéniteurs immatures LTC-IC Progéniteurs déterminés 0, 5 à 1% Formation de colonies* in vitro CFC 99% (5 semaines) (10 -21 jours) Cellules identifiables morphologiquement Myéloïdes Lymphoïdes *: Facteurs de croissance

Comment ces mécanismes se mettent-ils en place? • Régulation simultanée: – – Auto-renouvellement de la CSH Engagement dans la différenciation Spécification de la lignée Homéostasie • Mécanismes: – Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque) – Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de croissance

INDUCTION ET MISE EN ROUTE DU PROGRAMME DE DIFFERENTIATION

Engagement cellulaire micro. RNAs Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcription Contrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines

Régulation transcriptionnelle au cours des premiers stades de l’hématopoïèse. NOTCH-1, Bmi-1 GATA-2, HOX-B 4 CSH PU-1, GATA-1 CMP Progéniteur myéloide commun CLP Progéniteur lymphoïde commun

Facteurs de transcription et cytokines • PU. 1: facteur de transcription myéloïde • PU. 1 réprimé par Maf. B • La fixation de M-CSF induit l’expression de PU-1, sous l’influence de nombreux événements: – Intinsèques – Épigénétiques – externes Sarrazin et al. , Cell, 2009

Rôle prépondérant de certains facteurs de transcription De la cellule souche à la cellule différenciée

Rôle prépondérant de certains facteurs de croissance De la cellule souche D e l a c e l l u l e s à la cellule s différenciée o Kaushansky, NEJM, 2006, 2034 -45 u

Facteurs de croissance hématopoïétiques • • glycoprotéines monomères (sauf IL-5 et M-CSF, dimères) • • Redondance synthèse par un grand nombre de cellules (sauf l'érythropoïétine ou EPO, qui n'est élaborée que par le rein): Lymphocytes, fibroblastes, monocytes, cellules endothéliales, lymphocytes T et B, d' ou leur nom « cytokines » Synergies : – Nécessité de plusieurs signaux différents pour la mise en cycle des progéniteurs – Réponses prolifératives additives – Effets distincts et multiples d'une cytokines sur des cibles cellulaires différentes. • • action locale ( hormone): endocrine, paracrine, autocrine. Agissent sur un récepteur spécifique: – Niveau d'expression des récepteurs régulé (+ ou -). – dimérisation du récepteur – transduction d ’un signal via la phosphorylation du récepteur et des protéines associées vers le noyau – activation de la transcription de gènes donnés

Facteurs de croissance Hématopoïétiques (1) • Facteurs de promotion et de survie cellulaire, ex: – Stem cell factor (SCF) = kit ligand: – Viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes – Croissance des progéniteurs immatures myéloides et erythroblastiques avec d’autres cytokines – Indispensable à l’erythropoièse fœtale (foie) – FLT-3 ligand: – Croissance des progéniteurs immatures myéloides et mégacaryocytaires

Facteurs de croissance Hématopoïétiques (2) • Facteurs de prolifération et de différenciation, ex: – Non spécifiques de lignée: – Interleukine -3 (IL-3) : action sur toute la myélopoïèse – Interleukine 6 sur tous les progéniteurs – Spécifiques de lignée: – Granuleux/macrophagiques: GM-CSF, G-CSF, M-CSF – – lignée éosinophile : IL-5 lignée érythroïde : érythropoïétine (Epo) lignée méga : thrombopoïétine (Tpo) lignée lymphocytaire : – maturation : IL-2, IL-4, – croissance : IL-7 – différenciation plasmocytaire : IL-6

Modèle de l’hématopoïèse De la cellule souche D Kaushansky, NEJM, 2006, 2034 -45 e l a c e l l u l e s à la cellule différenciée s o u

Régulation négative de l’hématopoièse • TGF b (Transforming Growth Factor b ): un inhibiteur de l'entrée en cycle cellulaire des progéniteurs primitifs • TNF a (Tumour Necrosis Factor a ) agit en fait de manière différente (action inhibitrice ou stimulante) suivant les facteurs de croissance • MIP 1 a (Macrophage-Inflammatory Protein 1 a ) ne limite pas son action au tissu hématopoïétique et se trouve impliqué dans de nombreux processus inflammatoires. • Protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling: SOCS 1 -3, CIS) – La synthèse des SOCS est induite très rapidement in vivo et in vitro (apparition de m. RNA) en réponse à la stimulation des cellules cibles par les cytokines comme IL 2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon-g, EPO, GCSF, GM-CSF, Prolactine, Hormone de croissance.

Mode d’action des protéines SOCS

Synthèse de la différenciation des CSH • CSPH médullaires qui vont se différentier vers – – polynucléaires PNN ou PNE ou PNB, Globules rouges (GR) Mégacaryocytes (plaquettes) Lymphocytes (B, T, NK) • action intriquée de nombreux facteurs – Facteurs de croissance, interleukines – Molécules d’adhésion – Facteurs de transcription • 2 modèles d’étude: – Par les gènes spécifiques de la lignée – Par les déficits • Pathologies • Souris KO