Tlomrase et Cancer Tlomres Tlomrase Rgulation Tlomres Rgulation

Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase

Télomères Télomérase et Cancer Quelques dates Notion d’extrémités des chromosomes protégées WATSON Mort des cellules par perte de gènes vitaux Hypothèse d’OLOVNIKOV (1971) Perte progressive d’ADN au cours des réplications Point de départ des travaux sur télomères Greider et Blackburn 1985 Depuis 1996 Protozoaire : Tetrahymenia thermophila Mise en évidence d’un complexe Ribonucléoprotéique Constitué - Reverse Transcriptase (TERT) - ARN matriciel (TR) Télomères et Télomérases sont très étudiés Protozoaire : Tetrahymenia thermophila (in vivo) Modèles Levures : • Saccharomyces cerevisiae (in vivo) • Schizosaccharomyces pombe (in vivo) Souris : TR limitant (in vivo, souris invalidées) Homme : TERT limitante (in vitro)

Télomères Télomérase et Cancer Télomères Nécessité pour la cellule de différentier les extrémités de ses chromosomes des cassures dans l’ADN Système NHEJ Pour échapper aux systèmes de réparation des ADN endommagés et à la fusion inter-chromosomique Arrêt du cycle, Apoptose

Télomères Télomérase et Cancer Télomères ? Séquences ADN - situées aux extrémités des chromosomes - non codantes - constituées essentiellement d’un motif répété - longueur variable selon les espèces Organismes Uni¢aires Ciliés (Euplotes…) TTTTGGGG < 100 pb Levure (S. Cerevisiae) TG < 500 pb Flagellés(Tripanosome, Leishmania) TTAGGG < 100 pb Algues TTTTAGGG < 500 pb -homme TTAGGG > 10 kpb -souris TTAGGG > 50 kpb -tous les autres TTAGGG Chlamydomonas … Organismes Multi¢aires Vertébrés Truite Plantes TTAGGG Arabidopsis thaliana… TTTAGGG > 20 kpb 3 kpb > 10 kpb Insectes (lepidoptères) TTAGG Champignons (Neurospora) TTAGGG ? Nématodes (Ascaris, Caenorhabditis Elegans) TTAGGC ?

Télomères Télomérase et Cancer Régions télomériques non conventionnelles : • Drosophile : ÷ He. T-A (6 kpb) et TART (10 kpb) transposons non LTR ÷ Transposés régulièrement aux extrémités des chromosomes • Anophèle et oignon : ÷ Séquences très longues répétées, ÷ homogénéité des séquences est maintenue par des Crossing over non réciproques et ou des conversions de gènes Régions sub-télomériques ÷ homogènes au sein de l’espèce mais variables entre les espèces : • Longueur variable selon l’espèce • Tandems répétés ≠ télomères + = télomères dégénérés ÷ maintien de l’homogénéité par Crossing Over non réciproques

Télosome Télomérase et Cancer Télosomes : Modèles d’étude Modèles « in vivo » ==> les levures S. cerevisiae Schizosaccharomyces Pombe ≠ mais modèle « in vivo » plus proche de l’homme CONFIRMATION pour l’homme • « in vitro » ==> interaction des protéines entre elles ==> maintien en culture d’explants • Utilisation de souris invalidées pour les ≠ gènes impliqués dans le maintien des télosomes. ==> faisable car la longueur des télomères de souris permet l’obtention de 7 générations sans rallongement des télomères. ==> génération 8 apparition de souris stériles

Télosome Télomérase et Cancer Télosomes Passage d’une forme à l’autre ? Structure Boucle-T Nombre de TRF 1 Décrochage de TRF 1 Tankyrase ADP-ribose=> TRF 1 Forme réplicative ± 200 bases Ku Ku Ku TRF 1 TRF 2 Pot 1 200 bases Forme protégée et forme réplicative Brin 3’ saillant = Brin GT riche Brin 5’ = Brin CA riche

Télosome Télomérase et Cancer Télosomes : Protéines constituantes • TTAGGG Repeat Factor (TRF 1 et TRF 2) Structure Boucle-T • TRF 1 - Fixés sur les télomères sous forme d’homodimères -Stabiliseraient la T-loop -Empêcherait l’accés de la télomérase aux télomères - Nombre critique (? ) ==> passage à la forme réplicative • TRF 2 - se lie préférentiellement à la boucle D (in vitro) AGGGTTAGGGTTAGG - lié à RAD 50 et MRE 11 ==> Boucle D enzymes syst. réparat. de l’ADN -GGTT AGGGTTAGGGTTAGGG-3’ TTAGG - Rôle majeur suspecté dans ************* la protection des télomères CCAATCCCAATCCCAATCCC AATCet la stabilisation des boucles-D TRF 2 - Active également la dégradation des télomères - Sa sur-expression ==> raccourcissement des télomères

Télosome Télomérase et Cancer Télosomes Protéines constituantes • Pot 1 : - fixée à l’extrémité 3’ du brin TG - correspond à Cdc 13 p de S. cerevisiae Cdc 13 p ==> Contrôle positif de l’élongation (in vivo) Homme ? ÷ protection de l’extrémité en fixant Ten 1 & Stn 1 Boucle -T et TRF 2 ÷ recrutement de la TERT avant réplication Pot 1

Télosome Télomérase et Cancer Télosomes Protéines associées Véronique Gire MS/2005 • Rap 1 : ==> Rap 1 de S. cerevisiae - fixée sur TRF 2 et non sur l’ADN directement - rôle ? • Tin 2 : - fixée sur TRF 1 - rôle ? : Participerait au contrôle négatif de l’élongation des télomères -Tin 2 Régulation du cycle ¢aire -Tin 2/TRF 1 : régulation du cycle et de la longueur des télomères • Ku : - hétérodimère (70 et 80 k. DA) - Capitale dans la réparation des cassures d’ADN double brin - se fixe sur TRF 1 - Rôle ? : Absence Ku (mammifères) => fusion télomères - télomères • Tankyrase : - TRF 1 interacting, ankyrin-related, ADP-ribose polymerase - Activité poly ADP-ribose polymérase sur TRF 1 - Conduirait au décrochage de TRF 1 - Faciliterait l’accès de l’extrémité 3’ à la Télomérase - Posséderait également une fonction réparatrice de l’ADN…

Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase C G C A A U G T T A

Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée • 2 acteurs suffisants in vitro • Active en dimères 2 TR et 2 TERT 12 N • RT: Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR A B’ C D E C - Activité Reverse Transcriptase proche des RT rétrovirales - Pas de liaison avec h. TR Moriarty et al, Mol. Cell Biol. 2004

Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR • 2 acteurs suffisants in vitro • Active en dimères 2 TR et 2 TERT RID 2 N RID 2 T 12 A B’ C D E C • RID 2/T: - Interaction avec le pied de boucle P 6. 1 de h. TR Moriarty et al, Mol. Cell Biol. 2004

Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR • 2 acteurs suffisants in vitro • Active en dimères 2 TR et 2 TERT RID 1 RID 2 N • RID 1: T 12 A B’ C D E C - Liaison avec le pied de boucle P 1 de h. TR et C terminal de h. TERT - Nécessaire à la processivité mais pas à l’activité polymérase - Apporte avec C-term la spécificité par saut de la télomérase Moriarty et al, Mol. Cell Biol. 2004

Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR • 2 acteurs suffisants in vitro • Active en dimères 2 TR et 2 TERT • Processive : Type II par sauts TERT Boucle-T Forme réplicative Recrutement de TERT et de TR AUCCCAAUC TTAGGGTTAGGGTTAG Reverse transcription de la matrice TR Elongation d’un motif GGTTAG Translocation

Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée • 2 acteurs suffisants in vitro • Active en dimères 2 TR et 2 TERT • Processive : Type II par sauts Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR Facteurs auxiliaires protéiques Protéine Région interagissant Fonction ----------------------------------------------------------h. TERT associée TEP 1 aa 1 -350, 601 -927 inconnue Diskérine/Hsp 90 aa 1 -195 Assemblage/conformation 14 -3 -3 aa 1004 -1132 Localisation nucleaire h. TR associée TEP 1 nt 1 -871 inconnue h. GAR 1 h. TR H/ACA domain Stabilité, maturation, localisation Dyskerin/NAP 57 h. TR H/ACA domain Stabilité, maturation, localisation h. NOP 10 h. TR H/ACA domain inconnue h. NHP 2 h. TR H/ACA domain Stabilité, maturation, localisation C 1/C 2 nt 33 -147 Stabilité, maturation, localisation La nt 1 -205, 250 -451 Accessibilité aux télomères? A 1/UP 1 nt 1 -208 inconnue h. Stau nt 64 -222 Accessibilité aux télomères? L 22 nt 64 -222 h. TR processing, localisation? aa, amino acids; nt, nucléotides.

Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase

Régulation Télomères Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Télomérase Allongement ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) Au cours de la Réplication Erosion des télomères Par recombinaison

Régulation Télomères Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Allongement et Télomérase ? ? Tankyrase => décrochage de TRF 1 ? ? Déstabilisation de la T-loop ? ? Pot 1 => recrutement de la télomérase ? ? Elongation des télomères

ALT Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Allongement et ALT (Alternalive Lengthening of Telomeres) • Phénotype ALT + ==> identifié la première fois dans les ¢ tumorales PML (pro myelocytic leukemia) ==> Un accroissement non limité de la taille de leurs télomères ==> Pas de télomérase réactivée ==> Inactivation des répresseurs de l’activité ALT ==> Mise en évidence de corps nucléaires spécifiques (APB-ALT associated PML Bodies) • APB composé : • ADN télomérique extrachromosomal (ECTR-Extra Chromosomal Telomeric Repeats ) ==> Circulaire et linéaire • Protéines TRF 1 et TRF 2 • Protéines impliquées dans la réplication et la recombinaison (RAD 50, RAD 51, RAD 52, RPA, MRE 11, NBS 1, BLM, et WRN.

ALT Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Allongement et ALT (Alternalive Lengthening of Telomeres) Mécanismes d’échange non réciproque • validé par des télomères portant une séquence Tag • FISH => augmentation du nombre de Tag détectables => augmentation du nombre de chromosomes Tagués entre 2 chromosomes A partir de la T-Loop Par cercle roulant sur ECTR circulaire A partir d’ECTR linéaire

Erosion télomères Télomérase et Cancer Mécanismes impliqués dans l’Erosion Au cours de la Réplication 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Origine Réplication 5’ 3’ Fragments d’Okazaki 5’ 3’ ne commencent pas exactement à l’extrémité 3’ 5’ Fin de Réplication 3’ 5’ Enlèvement des amorces ARN des extrémités Exonucléases 5’=> 3’ ? Raccourcissement des extrémités

Erosion télomères Télomérase et Cancer Mécanismes impliqués dans l’Erosion Par échanges intrachromatidiens 3’ 5’ 3’

Erosion télomères Télomérase et Cancer Mesure de la longueur des télomères à la fin de leur vie Vitesse estimée de l’Erosion ¢ en culture 40 à 200 nucléotides/division In vivo 15 à 50 nucléotides/an Centenaires 100 ans Trisomie 21 5 à 6 kb 46 ans Progeria de Hutchinson-Gilford < 14 ans Lymphocytes en culture Arrêt des divisions Sénescence Suggère un lien potentiel entre sénescence ¢aire / vieillissement des tissus / mort des sujets ? Biopsies de derme Taux de SA-ß-Galactosidase En fonction de l’âge des sujets

Erosion télomères Télomérase et Cancer Essentiellement mais pas uniquement Erosion des télomères Sénescence proliférative ? Horloge mitotique Limitation du nombre de divisions ¢aires Mémoire du nombre des réplications Mécanisme Antiprolifératif

Sénescence proliférative Télomérase et Cancer Taille moyenne des télomères 10 -15 kb ¢ germinales ¢ souches/basales 5 -7 kb M 1 = H Point de Hayflick Sénescence Proliférative ¢ somatiques Divisions Cellulaires

Sénescence proliférative Télomérase et Cancer 5 -7 kb Nombre limité de TRF 1? Dissociation du télosome ou Changement de conformation ? Reconnu par la machinerie ¢aire comme de l’ADN endommagé (…) Induction p 16 INK 4 a ? Kinase ATM & PARP Inactivation Activation p 53 Induction p 21 WAF 1 Cyclin Dependant Kinase CDK 4 et 6 X p. RB-OH Active X p. RB-P Inactive Association à E 2 F Blocage du cycle en G 1/S Sénescence

Immortalisation Télomérase et Cancer ¢ somatiques Immortalisées Télomérase - Taille moyenne des télomères 10 -15 kb ALT + Action d’oncogènes « Inactivation » des gènes suppresseurs de tumeur 5 -7 kb 2 -4 kb 10 -7 Sénescence Pré-immortalisation Proliférative. Immortalisation M 2 Crise Divisions Cellulaires Immortalisation Pré-immortalisation Prolifération limitée (20 à 40) Dégradation des télomères Instabilité chromosomique Translocations… ¢ somatiques Immortalisées Télomérase + Mort massive des cellules Apoptose Prolifération illimitée Réactivation de télomérase ==> Stabilisation taille des télomères ou Réactivation de ALT ==> Pas de stabilisation taille des télomères

Immortalisation Télomérase et Cancer Effet de h. TERT ? Taille moyenne des télomères 10 -15 kb Expression ectopique d’h. TERT Immortalisation 5 -7 kb ¢ somatiques Immortalisées Pré-immortalisation 2 -4 kb Sénescence Réplicative Expression ectopique d’h. TERT Crise Divisions Cellulaires Immortalisation des fibroblastes en culture

Oncogènes Télomérase et Cancer Oncogène Sarc. . TERT Transformation Colonies en Agar mou Tumorigène « in vivo » Ras Immortalisation Inhibition de contact Permet la multiplication illimitée des cellules en culture Permet la pousse anarchique des cellules en culture Oncogène immortalisant Oncogène transformant

Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase

Télomérase et Cellules Télomérase et Cancer • Activité télomérase ¢ germinales > ¢ basales > ¢ somatiques • Classiquement dans ¢ somatique pas d’activité. Activité élevée = Tumeur • Activité décrite dans les lymphocytes • Régulation de l’activité télomérase => 3 niveaux => transcriptionnelle (TR et TERT) => post-transcriptionnelle (TERT) => post-traductionnelle (TERT)

Régulation Transcription Télomérase et Cancer h. TR h. TERT Constitutif m. TERT Régulé m. TR

Régulation Transcription Télomérase et Cancer Transactivateurs & Répresseurs ÞPas de CAAT box ni de TATA box ÞRégion GC riche îlot Cp. G autour de l’ATG ==> régulation par méthylation suspectée? Þ Identification de nombreux sites de fixation de facteurs de transcription Confirmation en ¢ : Þ Promoteur + luciférase Þ Surexpression Facteur de Transcription Þ si. RNA ATG Exon 1 -1000 -800 -600 -400 -200 1 200 Exon 2 400 600 pb

Régulation Transcription Télomérase et Cancer Boîtes E E box 2 1 ATG Exon 1 -1000 -800 -600 BRCA 1 Complexe c. Myc c-Myc-Max oncogène activant: prolifération, croissance et apoptose TGF-ß/Smad 3 -400 -200 1 200 Exon 2 400 600 pb USF 1 et USF 2 => répresseur sur E box Mad-Max Boîte E Compétition Antagonisme crucial pour activité Télomérase => répresseur sur E box

Régulation Transcription Télomérase et Cancer Boîtes GC En synergie avec Boîtes E E box 2 GC box 1 ATG 5 4 3 21 Exon 1 -1000 -800 -600 -400 -200 1 Exon 2 200 400 600 pb P 53 Complexe SP 1 Boîte GC SP 1 et SP 3 Certaines conditions recrutement Histones déacéthylases

Régulation Transcription Télomérase et Cancer Autres Eléments de Réponse E box 2 GC box 1 ATG 5 4 3 21 Exon 1 -1000 -800 -600 -400 -200 1 200 Exon 2 400 600 pb HER 2/Neu Ras EGF Raf ER 81 Métalothioléine Œstrogène E 2 F 1 : => direct (transcription) ETS boîte MT boîte ERE E 2 F MZF-2 Wilm’s tumor 1 tumor supressor Tissu spécifique (rein, gonades et rate) VDR : Vit D Recepteur WT-1 Myeloid cell-specific Zn finger protein 2 Progestérone : antagoniste Œstrogènes

Régulation Transcription Télomérase et Cancer Action des protéines virales sur la transcription E 6 HPV Tax HTLV 1 Lympho T NFk. B E 6 /E 6 AP HBX HBV p 53 c. Myc Sp 1 E Boxes GC Boxes USF 1 et 2 Ubiquitination LANA HHV 8 Kaposi

Régul Post-Transcription Télomérase et Cancer ATG Télomère h. TERT +> 16 exons Centromère 5 p 15 -2 Mb -41 kb m. RNA h. TERT 1132 aa N-teminal T-spécifique RT C-teminal Epissage différentiel Transcrit épissé alpha 36 bases 5’ Exon 6 Transcrit épissé béta Perte Exons 7 & 8 3 Transcrits avec insertion Dans divers Exons 4, 14, ou 15 -16

Régul Post-Transcription Télomérase et Cancer Fonction inconnue de ces Transcrits alternatifs chez l’homme Profils de transcrits toujours identique : Pas alléatoire Maintien du rapport transcrit codant / transcrits alternatifs Transcrit Alpha Seul en phase Régulation par compétition Effet négatif des transcrits alternatifs exogènes surexprimés EPISSAGE ALTERNATIF MECANISME ADDITIONNEL DE REGULATION DE L’ACTIVITE TELOMERASE

Régulation Post-Traduction Télomérase et Cancer Régulation post-traductionnelle de la télomérase Lymphocytes Amygdales Lymphocytes B et T circulants ARNm Télomérase taux identique Activité Télomérase différente ARNm TERT et RT détectables Modulation de l’activité télomérase par modifications posttraductionnelles de h. TERT Tissus ovariens normaux Pas d’activité Télomérase Action de ≠ inhibiteurs de kinase =>Sur cellules explantées de tumeurs =>Sur cordons ombilicaux maintenus en culture =>Sur cellules en cultures Au moins 3 kinases identifiées modifiant activité télomérase

Régulation Post-Traduction Télomérase et Cancer Kinase Site de phosphorylation Sur h. TERT Action Sur h. TERT Protein Kinase C ? Active Akt Proteine. Kinase 220 -GARRRGGSAS-229 817 -AVRIRGKSYV-826 Active Tyrosine Kinase c-Abl 308 -PSTSRPPRP-316 Inactive Cas des lymphocytes CD 4+ h. TERT produite dans le cytoplasme Translocation h. TERT-P dans le noyau INACTIVE phosphorylation dépendante ACTIVE

Régulation Télomérase et Cancer Activité Télomérase Régulée Via h. TERT Tumorigenèse Transcription Epissage Différentiel ? ? ? Post-traductionnel TERT autre fonction dans la cellule suspectée