Sindromul MEN 2 A Diagnostic molecular Andreea Ctan1

Sindromul MEN 2 A Diagnostic molecular Andreea Cătană1, Ioana Ilie 2, Felicia Petrișor 1, Carmen Georgescu 2, Ioan Victor Pop 1, Radu A. Popp 1 1 Departamentul 2 Clinica de Științe Moleculare nr. 3 UMF Iuliu Hațieganu, Cluj de Endocrinologie Cluj, UMF Iuliu Hațieganu, Cluj

MEN 2 A (Multiple Endocrine Neoplasia Type 2 A → este forma cea mai frecventă a sindromului MEN 2 (80% din cazuri). ü >90% indivizi dezvoltă carcinom medular tiroidian (CMT) → cea mai frecventă cauză de deces ü 57% → feocromocitom ü 15 -30% → tumori paratiroidă. ü Lichen plan, boală Hirshsprung → AD, penetranță completă și expresivitate variabilă → Etiologie: mutație activatoare la nivelul genei RET, care codifică un receptor tirozin kinazic, al cărui ligand aparține familiei GDNF (factorul neutrotrofic derivat din celulele gliale) Sindromul Sipple

Protooncogena RET Ø Gena RET (rearranged during transfection) - PROTO-ONCOGENĂ 10 q 11. 2 21 exoni MEN 2 A – mutații la nivelul domeniului ectracelular bogat in CISTEINĂ (codoni 609, 611, 618 și 620) și la nivelul exnului 11 (inclusiv codonii 630 și 634). Ø Aprox. 85% dintre mutațiile RET asociate MEN 2 A interesează codonul 634, din care 50% sunt consecința unei substituții Cys 634 Arg (Kloos et al. , Thyroid, 2009)

Asocieri genotip-fenotip în MEN 2 A ü 85% pacienți cu MEN 2 A au mutații la nivelul exonului 11, codonul 634 ü 15% pacienți cu MEN 2 A au mutații la nivelul codonilor 609, 611, 618 și 620 ü 50% dintre pacienții cu MEN 2 A cu mutații la nivelul codonilor 634 și 918 prezintă feocromocitom ü mutații la nivelul exonului 10 codonii 609, 611, 618, 620, exonul 15, codonii 791, 804 RAR feocromocitom ü Hiperparatiroidismul – mutații la nivelul codonului 634 (C 634 R) ü Boală Hirshsprung – exonul 10 codonii 609, 611, 618, 620 ü Lichen plan cutanat – codon 634 Mutații nivel 1 (609, 649, 768, 791, 790, 804, 891) risc scăzut de malignizare Mutații nivel 2 – risc crescut malignizare (634, 611, 618, 620, 631) – tiroidectomie profilactică < 5 ani

Prezentare caz • Pacientă 38 ani • 2012 ü Litiază renală (litotriție) ü Tulburare anxioasă generalizată ü Episoade paroxistice tahicardie și HTA (1 -2/zi) ü Ecografic- mase tumorale suprarenale 3, 4/2, 7 și 2, 7 cm, confirmare imagistică CT) § Fără alte investigații și evaluări. . . § Tratament anxiolitic și cu beta blocant (Bisoprolol) • 2014 (Clinica Endocrinologie UMF Cluj) ü tahicardie paroxistică recurentă, rezistentă la terapia cu Bisoprolol ü HTA paroxistică (BP = 110/75 mm Hg, criză BP = 200/100 mm. Hg) ü Lombalgii severe ü Obezitate (IMC = 31, 9 kg/m 2) • Istoric familial pozitiv pt. MEN 2 A, însă diagnosticul de screening molecular presimptomatic negativ!

Feocromocitom CT abdominal cu substanță de contrast: formaț tum suprarenaliene stg 52/44/40 mm, dr. 52/47/64 mm, litiază renală stg. Ø Adrenalectomie stg. laparoscopică cu pielotomie (litiaza renală) Ø Adrenalectomie dr. laparoscopică Terapie substituție § Glucocorticoizi (Hidrocortizon 25 mg/zi) § Mineralocorticoizi (Astonin H 0. 1 1 tb/zi)

Carcinom medular tiroidian Ultrasonografie tiroidiana Ø Ø Nodul heterogen, hipoecogen, cu margini slab conturate, fara halou 0. 42/0. 22 cm lob drept TSH=0, 89 u. U/ml (n: 0, 5 -4) FT 4=1, 20 ng/dl (n: 0, 89 -1, 76) ATPO=34, 5 UI/ml (n: <50) ATG=14, 0 UI/ml (n: <60) Ø Tiroidectomie totala cu disectia ganglionului adiacent (nivel VI) Ø Examen histopatologic carcinom medular bifocal (0, 5 cm superior dr si 0, 3 cm superior stg. ) fara semne de invazie angiolimfatica, margini lbere. GGl limfatic cu histiocitoza centrala. p. T 1 Nx. Mx. L 0 V 0 Ø terapie substitutie cu L-Tiroxina 100 µg/zi 13 February 2022 7

Adenom paratiroidian Axial T 2 Coronal T 1 RMN - Adenom paratiroidian inferior Ø ↑ Calcitonină = 60. 64 pg/ml Ø Paratiroidectomie stangă inferioară 13 February 2022 8 Sagital T 2

Lichen plan cutanat

Pedigree MEN 2 A Diagnostic molecular Pozitiv exon 11, TGC 634 TTC Tehnica utilizata SSCP (single strand conformation polymorphism) ? Germania (1997) CONFIRMARE Secventare !!! 1997 Pozitiv TGC/TTC 634 1999 Pozitiv TGC/TTC 634 1997 Pozitiv TGC/TTC 634 2000 11 ani 2 ani Pozitiv TGC/TTC 634 2000 Pozitiv TGC/TTC 634 Negativ TGC/TTC 634 IV. A 2000 1999 IV. B Diagnostic molecular Negativ exon 11, TGC 634 TTC Tehnica utilizata SSCP (single strand conformation polymorphism) Budapesta (1997 -2000)

Reevaluarea moleculară a pacientei Detecția mutației TGC 634 TTC de la niveul exonului 11 Tehnica utilizată PCR- RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) Ø Avantaje ü Accesibilă, ieftină, specificitate mare, rata scazută a rezultatelor fals pozitive/negative) Ø Dezavantaje ü Identifică doar mutațiile cunoscute Ø Ø Ø Extractia și purificarea ADN (sange venos periferic) Amplificarea ADN țintă (exon 11, gena RET) Digestia enzimatică a ampliconilor (ER specifice) Electroforeza fragmentelor rezultate (electroforeza gel agaroză) Interpretarea genotipurilor

Mutatia TGC 634 TTC , exon 11 gena RET tehnica PCR-RFLP Enzimă restricție Sat 1 –situs recunoaștere GCC/GGC Exon 11 RET gene Codon 634 primer Fw CCTCTGGCGGTGCCAAGCCTCACACCACCCACAGATCCACTGTGCGACGAGC TGC C/GGCACGGTGATCGCAGCC/GGC TGTCCTCTTCTCCTTCATCGTCTCGGTGCTGCTGTCTGCCTTCTGCATCCACTGCTACCACAAGTTTGCCCACAAGCCACCCATCTCCTCAGCT GAGATGACCTTCCGGAGGCCCAGGCCTTCCCGGTCAGCTACTCCTCTTCCGGTG primer Rev 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Control pozitiv nedigerat (235 pb) Control pozitiv (tatăl) Genotip mutant nediderat (proband) Genotip mutant (proband- mama) Genotip normal WT nedigerat (fiica) Genotip normal WT nedigerat (fiul) Genotip normal WT (fiul) Marker ADN 50 pb Control negativ de amplificare (H 2 O)

Rezultatele analizei moleculare 2014 2000 PCR RFLP Polymerase Chain reaction- SSCP (Single Strand Complementary Polymorphism) Restriction Fragment Lenght Polymorphism Pozitiv TGC/TTC 634 (martor pozitiv) Proband Negativ TGC/TTC 634 - 11 ani Pozitiv TGC/TTC 634 Negativ TGC/TTC 634 3 ani Calcitonină la limita superioară! Analiza secvențare (în lucru) Negativ TGC/TTC 634 Rezultat fals negativ ? Mutație "de novo" ? Polimorfism G 691 S ?

Protocol screening/diagnostic în MEN 2 A (European Consortium of MEN) I S T O R I C F A M I L I A L invest INVESTIGAȚII BIOLOGICE IMAGISTICĂ DIAGNOSTIC GENETIC MOLECULAR Carcinom medular tiroidian üCalcitonină plasmatică ↑ (cu 2 min înainte și 5 min după adm. de Ca iv. Test pozitiv = nivelul stimulat > 3 X niv. bazal (sau > 300 ng/L) Feocromocitom üCatecolamine urinare/24 ore↑ Adenom paratiroidian üCa + PTH simultană Ultrasonografie tiroidiană și paratiroidiană / CT/RMN Ultrasonografie gl. suprarenale / CT/RMN Mutație cunoscută (istoric familial pozitiv) PCR RFLP, ARMS PCR, ASO, Strip Assay, etc 85% pacienți cu MEN 2 A –mutații la nivelul codonului 634 al exonului 11 Mutație necunoscută SECVENȚIEREA Genei RET, EXONII 10, 11, 13, 14, 15 și 16 Polimorfismul G 691 S pt gena RET – varstă de debut precoce, nivel ↑ calcitoninei bazale

Beneficiile screening-ului diagnostic molecular în MEN 2 A • Profilaxia carcinomului medular tiroidian • Carcinomul medular tiroidian – curabil chirurgical (tiroidectomie totală), neoplasm slab responsiv la terapia clasică (chimio/radioterapie) • Rezultatele fals negative ale testării calcitoninei, ca marker biologic • Consult și sfat genetic preconcepțional/prenatal (implicații etice, testarea minorilor)

Vă mulțumesc!

Analize efectuate în cadrul Laboratorului de investigații genetice UMF Cluj Citogenetică moleculară Evaluare trombofilii (avort spontan, tromboze venoase, valvulopatii, terapie cu anticoncep ționale) Dr. Diana Miclea Dr. Cuzmici Zina Genetică moleculară Dr. Radu Popp Dr. Trifa Adrian Drd. Petrișor Felicia Dr. Farcaș Marius Dr. Cătană Andreea Trombofilii, avort spontan recurent, complica ții obstetricale Hemocromatoza primară tip I Boala Wilson Neoplasme mieloproliferative (policitemia vera, trombocitemie esentială, metaplazie mieloidă cu mielofibroza), anemie refractară cu sideroblaști inelari și trombocitoză Azoospermie, oligoastenoteratospermie, globozoospermie Șef Departament Prof. Dr. Pop Ioan Victor CARIOTIP sânge periferic Infertilitate, anomalii congenitale, hipostatura, ambiguitate sexuala, retard mental, etc Analiza cromosomială cu benzi G Hipostatura – FISH metafazic si interfazic Sindrom Prader Willi – FISH metafazic si interfazic Sindrom Di. George Sindrom Williams-Beuren Detecția cromozomului Y deletia SHOX (Xp 22) deletia SNRPN (15 q 11) deletia TUPLE (22 q 11) deletia ELN (7 q 11) Marker SRY Deficit de alfa 1 antitripsină Detecția genotipurilor Apo. E (e 2, e 3, e 4) Surditate neurosenzorială Fibroza chistică Factor V Leiden Protrombina G 20210 A PAI – 1 4 G/5 G MTHFR C 677 T MTHFR A 1298 C FXIII G 102 T CBS 844 ins 68 HFE C 282 Y H 63 D S 65 C ATP 7 B H 1069 Q JAK 2 V 617 F Microdeletiile AZF de la nivelul cromosomului Y (6 markeri STS) A 1 AT alele M, S, Z Apo. E (e 2, e 3, e 4) GJB 2 (conexina 26) mutatiile 35 del. G si W 24 X Deletiile GJB 6 (conexina 30) del F 508 W 1282 X Acondroplazii/Hipocondroplazii Sindromul MEN 2 A Rezistenta la terapia cu ACO N 1303 K G 1138 A G 1138 C N 540 K TGC 634 TTC TGC 634 TAC TGC 634 GGC TGC 634 CGC Cyp 2 C 19