Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando DIMENSIONE CARICA

Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando DIMENSIONE CARICA ELETTRICA

• Le molecole cariche interagiscono con gruppi funzionali presenti sulla fase stazionaria • La forza del legame proteina-matrice dipende dalla carica netta della proteina • La separazione si basa sulle differenze di carica netta (per valori di p. H definiti) delle diverse proteine • FASE STAZIONARIA FASE MOBILE • Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa, destrano ed agarosio solida – gruppi carichi liquida

Si basa sull’attrazione elettrostatica esistente tra proteine cariche e GRUPPI IONICI di carica opposta presenti sulla MATRICE Scambiatore cationico Scambiatore anionico

Il meccanismo dello scambio ionico è definito in termini di cinque passaggi distinti: Ø Diffusione dello ione sulla superficie di scambio Ø Diffusione dello ione all’interno della matrice fino al sito di scambio Ø Scambio degli ioni al sito di scambio Ø Diffusione dello ione che è stato scambiato sulla superficie dello scambiatore Ø Distacco selettivo della molecola di interesse 1. Variazioni di p. H e/o di forza ionica 2. Eluizione per affinità → è introdotto nel sistema uno ione che presenta affinità maggiore per lo scambiatore rispetto allo ione legato

Proteine con carica + Proteine con carica -

- Scambiatore Proteine con carica + Proteine con carica - - -

- Scambiatore Proteine con carica + Proteine con carica - - -

CENTRIFUGAZIONE - Scambiatore Proteine con carica + Proteine con carica - - - - -

Soluzione di lavaggio - - - -

Soluzione salina concentrata - - - -

Eluizione - - - -

_ _ _ R-CH 2 -COO- + + + R-CH 2 -COO- _ _ R-CH 2 -COO- _ + + +

Cl. Na+ R-CH 2 -COOR-CH 2 -COO- Na+ Cl- + + + Cl- Na+ Cl- R-CH 2 -COO- Na+ R-CH 2 -COO- Cl- + + Cl-

Na+ Cl- Na+ Na+ R-CH 2 -COO- Na+ R-CH 2 -COO- Na+ Cl- Cl- R-CH 2 -COO- Na+ Na+ Cl- + + + Cl. Cl- Cl. Na+ Cl- Cl. Cl-

Cromatografia in batch - - - -

Cromatografia su COLONNA

[SALE]

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Effetti del p. H sulla resina scambiatrice Gruppo CARBOSSIMETILICO scambiatore debole di cationi R-CH 2 -COOH = R-CH 2 -COO- p. Ka ~ 4. 5 Gruppo PROPILSOLFONICO scambiatore forte di cationi R-CH 2 -CH 2 -SO 3 H = R-CH 2 -CH 2 -SO 3 p. Ka < 1

Gruppo amminico terziario scambiatore debole di anioni R | R-CH 2 -N: | R = p. Ka ~ 8. 5 R | R-CH 2 -NH+ | R R | R-CH 2 -N+-R

Effetti del p. H sulla carica delle molecole proteiche p. I = 5. 5 Proteinan+ Proteinan 4 7 10 p. H

Effetti del p. H sulla carica delle molecole proteiche p. I = 8. 5 Proteinan+ 4 Proteinan 7 10 p. H

Ø Si definisce capacità totale di scambio il numero di milliequivalenti di ioni scambiabili, riferito ai grammi di scambiatore secco o all’unità di volume della resina idratata Ø Elettroliti deboli, i quali sono ionizzati a valori estremi di p. H, potranno essere separati solo su scambiatori forti, in grado di operare in un ampio intervallo di p. H Ø Per gli elettroliti forti si preferisce ricorrere a scambiatori deboli, i quali non sono in grado di legare le impurità fornite di carica presenti nel campione e possiedono caratteristiche di eluizione migliori Ø Il p. H del tampone adoperato deve essere di almeno una unità inferiore o superiore al punto isoionico dei composti da separare

• Scambiatore cationico forte • p. H 1 -2 (tutti gli aa si legano) • Eluizione tramite aumento di p. H e forza ionica: 1. aa acidi (es. aspartato e glutammato) 2. aa neutri (es. glicina e valina) 3. aa basici (es. lisina e arginina) • Rivelazione tramite ninidrina

VANTAGGI • Possibilità di caricare grandi volumi • Eluizione della proteina di interesse in un piccolo volume SVANTAGGI • Esecuzione in due tempi • Eluizione in un tampone a p. H e forza ionica diversi dal tampone iniziale • Possibilità di selezionare solo molecole ionizzabili

Determinazione della concentrazione proteica mediante METODO DI BRADFORD Il colorante Coomassie® Brilliant Blue G-250 nella sua forma libera presenta un massimo di assorbimento a 465 nm (marrone) → il legame alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante a 595 nm (blu) La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteine presenti nel campione in esame L’incremento di assorbanza a 595 nm (intensità del colore blu) è proporzionale alla concentrazione proteica

COSTRUZIONE DI UNA RETTA DI TARATURA v Proteina a concentrazione nota (BSA) v Colorante (Bradford) 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml

Camp. H 20 Camp. µl µl Bianco 500 Bradford µl Abs 595 nm M -- 500 0, 423 0, 453 0, 438 1 499 1 500 0, 598 0, 639 0, 619 0, 181 2 498 2 500 0, 68 4 496 4 500 0, 796 0, 811 0, 804 0, 366 8 492 8 500 1, 001 0, 998 1, 000 0, 684 0, 682 0, 244 0, 56 µg/ml

Assorbanza a 595 nm

Camp. H 2 0 µl Bianco 500 1 499 2 Camp. µl Bradford µl Abs 595 nm M 500 0, 423 0, 453 0, 438 1 500 0, 598 0, 639 0, 619 0, 181 498 2 500 0, 68 4 496 4 500 0, 796 0, 811 0, 804 0, 366 8 492 8 500 1, 001 0, 998 1, 000 pool 490 10 500 #1 490 10 500 #2 490 10 500 #3 490 10 500 #4 490 10 500 0, 684 0, 682 0, 244 0, 56 µg/ml

Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando DIMENSIONE CARICA ELETTRICA AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE

Ø Si basa sulla specificità delle interazioni biologiche per ottenere la separazione e la purificazione delle molecole Ø Un ligando specifico per la molecola di interesse è legato covalentemente ad una matrice insolubile Ø E’ necessario che le molecole da isolare siano in grado di legare il ligando in maniera specifica e reversibile Ø FASE STAZIONARIA FASE MOBILE solida – ligando immobilizzato liquida

• Deve possedere un numero sufficiente di gruppi chimici, ai quali possa essere legato covalentemente lo specifico ligando • Deve essere stabile nelle condizioni di legame e durante la successiva eluizione • Deve interagire solo debolmente con le altre macromolecole, riducendo così al minimo l’adsorbimento aspecifico • Le matrici più utilizzate sono i destrani (Sephacryl S), agarosio (Sepharose, Bio-Gel A), poliacrilammide (Bio-Gel P), polistirene (Bio-Beads S), cellulosa

Ø Per evitare che il legame del ligando alla matrice possa interferire con la sua capacità di legarsi poi alla macromolecola, è preferibile interporre un braccio spaziatore tra ligando e matrice Ø La sua lunghezza è critica per l’efficienza della cromatografia (la lunghezza ottimale è tra 6 e 8 atomi di carbonio): 1) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il ligando e la molecola da purificare 2) Se troppo lungo può instaurare interazioni idrofobiche con le molecole proteiche

GENERICO: un ligando che mostri una selettività di gruppo, dal momento che è in grado di legare gruppi affini di molecole che possiedono una similarità chimica insita molto ampia, ad es. poly-(U) per m. RNA SPECIFICO: un ligando che sia in grado di legare in maniera specifica una data molecola, ad es. un analogo di un substrato per purificare un enzima o ioni nickel per code di istidina