Hafta IX PCR Temelli Genetik Analiz Yaklamlar Mutasyon

Hafta IX PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri I Prof. Dr. Hilâl Özdağ

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ ØSSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) ØHA (Heteroduplex Analysis) ØCEHA/CE-SSCP (Capillary Electrophoresis HA) ØTGCE (Temperature Gradient Capillary Electrophoresis ØDHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØDenatüre edici olmayan (Native) ØDenatüre edici (Formaldehitli) ØPoliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ØDenatüre edici olmayan (Native) ØDenatüre edici (Üreli) ØKapiller Elektroforez (CE) ØDenatüre edici olmayan (Native) ØDenatüre edici

ELEKTROFOREZ ØElektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre yürür. ØDenatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha ziyade konformasyonlarına bağlı olarak yürür. ØDenatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil yapı oluşturamayacakları için moleküler ağırlıklarına göre yürürler.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØDenatüre edici olmayan (Native) ØBüyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA gibi) %0. 8 -1 arası jel hazırlanmalıdır. ØPCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası) %2’lik jele ihtiyaç vardır. ØRFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10 -20 bç farklı fragmentleri ayırmak için Nu. Sieve benzeri agaroz türevleri ile rezolüsyon arttırılabilir. Metaphor agaroz ile 3 -4 bç farkı ayırmak mümkündür.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØAgaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris Asetik asit EDTA) ile hazırlanır. ØDNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile kesilmiş genomik DNA’yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur. ØKısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØTBE 5 X veya 10 X konsantrasyonda hazırlanıp 1 X konsantrasyonda kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti oluşturur. ØTAE 50 X konsantrasyonda hazırlanabilir. ØTAE’nin hazırlama maliyeti TBE’ye göre daha düşüktür.

ELEKTROFOREZ ØAgaroz Jel Elektroforezi ØDenatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde kullanılır. Özellikle Northern blot analizi yapılacaksa jeli bu şekilde hazırlamak şarttır. Ancak yalnızca RNA’nın varlığına/yokluğuna ve bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz hazırlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde jelin RNaz’sız ortama uygun şekilde hazırlanması gerekmektedir.

ELEKTROFOREZ ØPoliakrilamid Jel Elektroforezi ØAkrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum Persülfat (APS) aracılığıyla TEMED’in katalizörlüğünde çapraz bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir. ØAPS her defasında taze hazırlanmalıdır.

ELEKTROFOREZ ØPoliakrilamid Jel Elektroforezi ØAkrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir. ØAkrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir. ØAkrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan porların çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler; 19: 1/29: 1/39: 1 gibi ØMDE (Mutation Detection Enhancement) Jel

ELEKTROFOREZ ØKapiller Elektroforez ØDonmayan akrilamid bazlı özel polimerler kullanılır. Bu polimerlerin nativ veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur.

ELEKTROFOREZ ØPCR temelli mutasyon analiz tekniklerinde amaç olası dizi değişimlerinin analiz edilen DNA fragmentinin konformasyonuna olan etkisinin tespit edilmesidir.

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ SSCP/HA

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ CE-HA CE-SSCP