Hafta X PCR Temelli Genetik Analiz Yaklamlar Mutasyon

Hafta X PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri I Prof. Dr. Hilâl Özdağ

DHPLC Transgenomic/ WAVE http: //www. transgenomic. com/flash/DHPLCFlash 2. asp

DHPLC BRCA ex 1 CAATAGGTAGCGATTCTGACCTTCGTACAGCAATTACTGTGATGCAATAA GCCGCAACTGGAAGAGTAGAGGCTAGAGGGCACTTTATGGCAAACT CAGGTAGAATTCTTCCGTCTCTTTCCTTTTACGTCATCCGGGGG CAGACTGGGTGGCCAATCCAGAGCCCCGAGAGACGCTTGGCTCTTTCTGT CCCTCCCATCCTCTGATTGTACCTTGATTTCGTATTCTGAGAGGCTGCTG CTTAGCGGTAGCCCCTTGGTTTCCGTGGCAACGGAAAAGCGCGGGAATTA CAGATAAATTAAAACTGCGCGGCGTGAGCTCGCTGAGACTTCCT GGACGGGGGACAGGCTGTGGGGTTTCTCAGATAACTGGGCCCCTGCGCTC AGGAGGCCTTCACCCTCTGGGTAAAGGTAGTAGAGTCCCGGGAAA GGGACAGGGGGCCCAAGTGATGCTCTGGGGTACTGGCGTGGGAGAGTGGA TTTCCGAAGCTGACAGATGGGTATTCTTTGACGGGGGGTAGGGGCGGAAC CTGAGAGGCGTAAGGCGTTGTGAACCCTGGGGAGGGGGGCAGTTTGTAGG TCGCGAGGGAAGCGCTGAGGATCAGGAAGGGGGCACTGAGTGTCCGTGGG GGAATCCTCGTGATAGGAACTGGAATATGCCTTGAGGGGGACACTATGTC TTTAAAAACGTCGGCTGGTCATGAGGTCAGGAGTTCCAGACCAGCCTGAC CAACGTGGTGAAACTCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCG TGGTGCCGCTCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTAGAAC C with 851 base pairs Melting temperature of entire strand: 61. 25° Temperature = 55° Celsius: 1 -3, Temperature = 56° Celsius: 4 -5, Temperature = 57° Celsius: 777 -789, Temperature = 58° Celsius: 6 -6, 776 -776, 790 -791, Temperature = 59° Celsius: 7 -48, 302 -312, 773 -775, 792 -792, Temperature = 60° Celsius: 49 -138, 297 -301, 313 -314, 771 -772, Temperature = 61° Celsius: 139 -296, 315 -316, 654 -770, 793 -851 Temperature = 62° Celsius: 317 -653, This sequence should be run at all of the following temperatures to ensure detection of all polymorphisms. Recommended temperature: 56° http: //insertion. stanford. edu/melt. html 62°

DHPLC CBP Exon 6 A. Rothan’dan

DHPLC A. Rothan’dan

DHPLC A. Rothan’dan

DHPLC Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002; 306: 63 -73.

DHPLC

DHPLC = denaturing high-performance liquid chromatography. Ezzeldin et al. Ann Biochem. 2002; 306: 63 -73.

Karıştırma testi DHPLC P 300/EXON 16 4239 G->T E 1014 X

Karıştırma testi DHPLC CBP/EXON 31. 1 5371 -8 INSA

DHPLC HDAC 2 EXON 1 Karıştırma

HDAC 2 143 Ins. CAG

DHPLC HDAC 2 EXON 12 Karıştırma

HDAC 2 1573 Del. A HCT 15

HSUV 39 H 2 -11 Ins. A (? ) SSCP

Kapiller Elektroforez

Genel Primerlerle işaretleme

P 300 4239 G>T (E 1014 X)

P 300 4239 G>T (E 1014 X )

CBP IVS 21 -4 del 22

CBP IVS 21 -4 del 22

CBP IVS 31 -7 Ins. A

CBP IVS 31 -7 Ins. A

TGCE Temperature Gradient Capillary Electrophoresis http: //www. spectrumedix. com/7144_9155163437/blank/browse. asp? a =383&BMDRN=2000&BCOB=0&c=53494

Hafta IX PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları Mutasyon Analiz Teknikleri III Prof. Dr. Hilâl Özdağ

Bir sonraki aşama…. 1. SSCP, HA, DHPLC, TGCE benzeri bir teknikle saptadığınız ve incelediğiniz DNA fragmentinde konformasyonel değişime neden olan dizi değişiminin ne olduğunu ortaya çıkarmak, 2. İncelediğiniz DNA fragmentini bir indirekt yöntemle analiz etmeden doğrudan dizi bazında değerlendirmek, 3. Klonlamak üzere hazırladığınız DNA fragmentine klonlama öncesi aşamalarda (PCR) hatalı bir baz girip girmediğinden emin olmak için ØBir sonraki aşama DNA dizi analizidir.

DNA DİZİ ANALİZİ

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ ØMUTASYONU ÖNCEDEN BİLİYOR VE YENİ BİR ÖRNEK GRUBUNDA VARLIĞINI SORGULAMAK İSTİYORSANIZ ØRFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) ØASA (Allele Specific Amplification) ØPrimer Extension

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ RFLP Yabanıl Tip Allel AGATCT TCTAGA RE kesim bölgesi Mutant allel AGAGCT TCTCGA RE bölgesi kaybolmuş

PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ ASA

Primer Extension : Bağlanma: Primere bir nt eklenmesi Uzama: Saptama: Floresans

Primer Extension :