Eletroforese de Protenas em Gel de Poliacrilamida 1

Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida 1 -Introdução 2 -Determinação da Malha no Gel 3 -Eletroforese em condições desnaturantes SDSPAGE 4 -Visualização das proteínas separadas por SDSPAGE Edmar Vaz de Andrade

1 -introduçao PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Poros (malha) com dimensões moleculares, onde a separação no gel ocorre de acordo com a filtração em gel e com mobilidade eletroforética das moléculas. Indicada para separação de: DNA Proteínas

2 -Determinação da Malha no Gel Monômeros Polímero formado pela reação entre Acri-Bis acrilamida Ligação cruzada Acri. Bis N, N’-metilenobisacrilamida Acri-Bis: acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida

2 -Determinação da Malha no Gel A polimerização entre Acri-Bis é catalisada por radicais livres APS: persulfato de amônio. Se decompõe naturalmente formando radicais livres. TEMED: estabiliza os radicais livres formados a partir do APS.

2 -Determinação da Malha no Gel A formação do polímero entre acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida determina a dimensão dos poros formados (malha) no gel. Depende da quantidade de ligações cruzadas: Varia em função da concentração de acrilamida e N, N’-metilenobisacrilamida

3 -Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

3 -Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Desnaturação da proteína: SDS-PAGE Aquecimento a 100 °C β-mercaptoetanol: agente redutor SDS: dodecil sulfato de sódio. Detergente aniônico forte. Interage com a proteína de modo independente da seqüência primária (proporcional a massa molecular) 1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos

3 -Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Efeito do SDS sobre as proteínas desnaturadas: Desnaturação da proteína Conformação linearizada Carga líquida negativa Ligaçao de SDS com a / proteína

3 -Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Gel concentrador Gel separador Aparato para eletroforese em SDS -PAGE

3 -Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

4 -Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE Coloração por azul brilhante de Coomassie

4 -Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE k. Da 75 50 Quitinase de Crhomobacterium violaceum expressa em Escherichia coli 35 30 25 Coloração por azul brilhante de Coomassie