ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA GEL DE POLIACRILAMIDA PARA

ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA

GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANÁLISE DE ÁCIDOS NUCLEICOS �Os geis de poliacrilamida são usados para separação de proteínas e pequenos fragmentos de DNA e RNA (cerca de 5 a 500 pb). � A poliacrilamida também pode ser usada quando pequenas quantidades de DNA ou RNA são analisadas ou quando é necessária uma maior resolução do que a obtida com o uso de géis de agarose.

* Acrilamida e Bisacrilamida * A acrilamida é uma molécula linear *A bisacrilamida é em forma de "T“ * Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-acrilamida na presença de persulfato de amônio e tetrametilenodiamina (TEMED) *Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação

�Os geis são adicionados entre duas placas de vidro pela polimerização de uma solução de monômeros de acrilamida em cadeias de poliacrilamida até a obtenção de uma matriz semi-sólida O tamanho dos poros pode variar ajustando a concentração de acrilamida e Bis-acrilamida

Principais vantagens do uso de géis de poliacrilamida �São formados poros mais regulares e de tamanho uniformes �Permite a aplicação de maiores quantidades de amostra; ate 10 ug de DNA podem ser aplicado(em um único poço sem perda significativa de resolução). �São utilizados para a recuperação e a purificação de DNA e RNA, devido à relativa pureza de seus ingredientes. �A acrilamida é uma matriz de gel mais resistente que a agarose, portanto, não quebra facilmente.

Características �O gel de poliacrilamida é formado por um monômero de acrilamida (CH 2=CH-CO-NH 2) e por um cross-linker que copolimerizam em longas cadeias com ligação cruzadas covalentes. Dessa forma, é mais difícil de ser preparado e mais tóxico tanto em pó quanto em solução, em relação à agarose.

Características �O tamanho do poro do gel é determinado pela porcentagem total de acrilamida (entre 3, 5 e 20%) e pela razão desta em relação a bisacrilamida(uma molécula de bisacrilamida para cada 29 monômeros de acrilamida). �Caso as amostras a serem analisadas contenham uma mistura de ácidos nucleicos com grande variedade de peso molecular, é possível usar um gel com gradiente de concentração.

Materiais utilizados: �Cuba de eletroforese vertical; �Placas de vidro, espaçador, grampos e pente para a montagem de um gel; �Provetas; �Pipetas graduadas; �Pipetas semi-automáticas e ponteiras; �Acrilamida a 40%; �APS 10%; �TMED; �TBE 10 x; �Tampão de carregamento de amostra.

Preparo do gel �Desengordurar as placas de vidro. �Montar as placas utilizando grampos e espaçadores. �Pipetar os seguintes reagentes: �Reagentes Volumes �dd. H 2 O 17, 0 ml �Acrilamida a 40% 5, 0 ml �TBE 10 x 2, 5 ml �APS 10% 50 µl �TMED 30 µl �Volume final 24, 78 ml

Procedimento �Colocar a placa montada em uma superfície plana e aplicar todo volume. �Colocar o pente após a aplicação do gel e aguardar por alguns minutos a polimerização. �Retirar o pente e montar a placa na cuba eletroforética. �Pipetar em cada poço 4 µl de amostra + 6 µl de tampão de carregamento de amostra. �Ligar a fonte e colocar para correr a 100 w, 70 mÅ por 1’ 30”.

Resultado da eletroforese dos produtos de PCR de p 53 Arg(A) e p 53 Pro(B) em PAGE 8% corado por Nitrato d Prata.