Eletroforese em gel diferencial Difference gel electrophoresis DIGE

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) José Maurício Maciel Cavalcante PPGCV-UECE

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) É uma metodologia de eletroforese (2 D) onde é utilizado até três diferentes amostras de proteínas marcadas com corantes fluorescentes (Ex. : Cy 3, Cy 5, Cy 2) antes da eletroforese 2 D. Após a corrida eletroforética, o gel é escaneado comprimento de onda de excitação de cada corante um após o outro. É utilizado para observação de mudanças no perfil proteico entre amostras. Ex: Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e doentes. Vantagem sobre a eletroforese 2 D tradicional: - Evita diferenças do perfil eletroforético devido à variações entre géis - Consome menos tempo

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Cy. Dye Família cianinas (corantes sintéticos) Três corantes com diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão: Cy 2, Cy 3 e Cy 5

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Marcação mínima (minimum labelling) Corante ligado à N-hidroxi-succinimidila (NHS) Ligação covalente ao resíduo de lisina da proteína

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Marcação mínima (minimum labelling) • Marcação de 1 -2% das proteínas disponíveis e apenas uma única lisina/proteína é marcada (“um corante por proteína”) • Carga da lisina carga do Cy. Dye: p. I da proteína não é alterado. • Corante x PM das proteínas marcadas proteínas de baixa massa molecular • Pode ser utilizado para espectrometria de massa • Alta sensibilidade: detecta até 125 pg de proteína

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Marcação por saturação (saturation labelling) • Apenas Cy 3 e Cy 5 podem ser modificados para técnica • Usado para pequenas quantidades de proteína 5 µg • Corantes ligados à maleimida ligação covalente ao grupo tiol dos resíduos de cisteína Todos os resíduos de cisteína são marcadas • Corantes possuem carga elétrica neutra, não altera p. I das proteínas

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Observações sobre a preparação das amostras - Anfólitos e DTT – competem com a ligação do marcador com a lisina Não podem estar presentes antes da reação - p. H 8, 5 – Maior eficiência para marcação - [proteína]: 1– 10 mg/ml (ótimo 5 mg/ml)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Observações sobre a preparação das amostras - 1 μl sol. de trabalho (400 pmol) em vol. de amostra com 50 μg de proteína - Homogenização (vortex) - Centrifugação (sobrenadante) - Incubação em gelo 30 min no escuro Obs: pode ser processada imediatamente ou armazenada -70 o. C/ 3 meses Eletroforese: placas de vidro de baixa fluorescência

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Uso do padrão interno - Utilizado para eliminar a variação entre géis com uso da técnica DIGE (experimentos multi-amostra). - Uso de um pool das alíquotas proteicas - Utilizado em todos os géis DIGE - Permite medir a quantidade de proteína de cada amostra em relação ao padrão interno - Possibilita <10% de variação no nível de expressão proteica, com 95% de confiança

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Gel Cy 2 Cy 3 Cy 5 1 Pooled internal standard Control 1 Sample A 1 2 Pooled internal standard Sample B 2 Control 2 3 Pooled internal standard Control 3 Sample B 1 4 Pooled internal standard Sample B 3 Sample A 3 5 Pooled internal standard Sample B 4 Sample A 4 6 Pooled internal standard Sample A 2 Control 4 Exemplo de desenho experimental com DIGE com um controle (Control) e três tratamentos (A, B, C), cada um com três repetições (1, 2, 3)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Digitalização das imagens Typhoon 9400 (GE Helthcare) Autoradiografia Fluorescência excitação azul (457, 488 nm) (Cy 2) Fluorescência excitação verde (532 nm)(Cy 3) Fluorescência excitação vermelho(633 nm) (Cy 5) Quimoluminescência

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Software para a análise de experimentos com DIGE De. Cyder (v 7. 0 - GE Healthcare) - Análise diferencial in-gel - Análise de variação biológica (entre geis) - Módulo de análise estatística - Remoção de artefatos - Subtração background Plataforma: R$124. 195, 40

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