Biyoteknoloji iin Mikrobiyoloji 1 TARIM ZORLU EVRESEL KOULLARA

Biyoteknoloji için Mikrobiyoloji 1

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON • Bitki habitatlarının genişletilmesi; • • • bitkilerin soğuk, sıcak, kuraklık gibi koşulların yanı sıra, yüksek tuz konsantrasyonu ya da nemli koşullarda canlı kalma, alkalin topraklarda demir eksikliğine direnç gibi faktörlerin sağlanması ile olabilir. • Çevresel stres koşullarına direnç, çoğunlukla birden fazla gen tarafından kontrol edilmektedir ve bu nedenle bir organizmadan diğerine aktarılması zor bir özelliktir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON • Trehaloz bir glikoz disakkarididir. • Fungus ve omurgasızların biyolojik membranlarında kararlı bir çözünen olarak görev yapar. • Böylece kuruma sırasında oluşacak hasara karşı organizmayı korur. • Pek çok bitkideki trehaloz miktarı saptanamayacak kadar düşüktür. E. coli’de trehaloz biyosentezinden sorumlu ots. A-ots. B genleri pirince aktarılmıştır. Tek bir transformasyon sonrasında yüksek katalitik etkinliğe sahip trehaloz üretimi gerçekleştirilmiştir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON • Bu genlerin farklı şekilde düzenlenmesi sonucunda • 1)doku spesifik ve 2)stres koşulları altında indüklenecek şekilde iki farklı konstrakt düzenlenmiştir. • İlkinde gene transit peptit ilave edilmiş ve ardından rbc. S geni promotorunun kontrolü altına yerleştirilmiştir. Buradaki amaç gen ürününü kloroplasta yönlendirmektir. • İkinci durumda ise gen absisik asit ile indüklenebilen bir promotor altına yerleştirilmiştir. Burada ots. A-ots. B enzim füzyonu sitosolde kalır. Bu oluşturulan konstraktlar Agrobacterium aracılığı ile pirince aktarılmıştır.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Trehaloz • Transgenik pirinç hatları, bağımsız doğal pirinçler ile karşılaştırıldığında; kuraklık, tuz, düşük ya da yüksek sıcaklık gibi stres koşulları altında yaşamlarını idame ettirmiştir. • Transgenik pirincin trehaloz içeriğinin, doğal tip pirinçten 3 -9 kat daha fazla olduğu yapılan çalışmalar sonucunda tespit edilmiştir.

• Her bir konstraktı içeren pirincin detaylı analizi sonucunda transgenik olmayan pirince kıyasla fotosistem II’nin daha az oksidatif hasar içerdiği (bu durum fotosentez için daha yüksek kapasite sağlar) yüksek düzeyde çözünmüş karbonhidrat, ve stres koşulları altında köklerdeki K+/Na+ dengesini kontrol yeteneğinde artış tespit edilmiştir. • Bu sonuçlar pirinçte trehalozun karbon metabolizmasında rol alan genlerin ifadesi üzerinde görev alan bir regülatör olduğunu göstermektedir. • Ayrıca iyon alımı ve muhtemelen diğer işlerde de görev almaktadır. Farklı kökene sahip organizmalarda aynı ürünün sentezini katalize eden homolog genlerin varlığı ürünün rolünün evrensel olacağını garanti etmez. • Transgenik pirinçlerin ilk alan denemeleri umut vaad edicidir ve aralıklı yağışın olduğu ve toprağın tuzlu olduğu bölgelerde gelişme olasılığı sunmaktadır.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Herbisitlere (Yabancı ot öldürücü) Direnç • Geniş etki spektrumuna sahip pek çok herbisit; ürün ve yabani ot arasında ayrım yapmamaktadır. • Ekinler çeşitli herbisitlere karşı dirençli hale getirilebilir. • Bu tür genetiği değiştirilmiş bitkilerin ekim alanları, yabani ot istilasına uğradığı takdirde, herbisitler yalnızca yabani otlara etki gösterecektir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Pestisitlere direnç • Bacillus thuringiensis bakterisinin bazı suşları lepidopterlerin epitelyum hücrelerini permeabilize eden endotoksin protein üretir. • Bacillus thuringiensis endotoksinini kodlayan genler, tütün, domates ve pamuğa transfer edilmesinin yanı sıra , bu bitkilerde ifadesi sağlanmıştır. • Saha denemelerinde transgenik domates ve tütün bitkilerinin yaprakları, tırtıl larvaları tarafından biraz tahrip edilirken, aynı koşullar altında geliştirilen kontrol bitkisinin yaprakları dökülmüştür. • İnsektisidal protein kodlayan Bacillus thuringiensis cry genlerini içeren mısır ve pamuğun, 2003 yılında yapılan bir araştırma sonucunda dünyada ekim alanlarının %26’sını teşkil ettiği belirlenmiştir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Pestisitlere direnç • Pestisit direncini sağlamak için uygulanan bir başka yol ise Clavibacter xyli subsp. cynodontis bakterisine Bacillus thuringiensis endotoksinini transfer etmek olmuştur. • Bu organizma genellikle Bermuda çim bitkisinde bulunmaktadır. Ancak özel bir amaç için örneğin mısır bitkisine inoküle edilirse gövde yapısının hücrelerinde popülasyon 108 g’ a ulaşabilir. • Endotoksin ifadesine sahip Clavibacter xyli suşları lepidopter larvalarının beslendiği yaprak ve gövde kısımlarının korunmasında umut vaad etmektedir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Patojenik bakterilerin, fungusların ve parazitlerin kontrolü • Böcekler ve funguslar gibi çeşitli bitki zararlılarının hücre duvarları da yapısal bileşen olarak “kitin” içerir. • Birçok bakteri (örneğin Serratia, Streptomyces ve Vibrio) “kitinaz” adı verilen kitini parçalama özelliği olan enzimler üretirler. • Bakteri kaynaklı bazı fungal hastalıklar kitinaz üretimi ile ilişkilendirilmiştir. • Toprakta bulunan ve kitinaz kodlayan farklı bakterilerden izole edilen genler Pseudomonas fluorescens’e klonlanmıştır. Rekombinant suşların fungal hastalıkları kontrolündeki etkinlik düzeyi henüz tam olarak bilinmemektedir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Viral hastalıklara direnç • Bitki virüs hastalıklarını kontrol etmek zordur. • 1980’lerin ortalarında yapılan bir çalışmada Tütün mozaik virüsü (TMV) kapsit proteinini kodlayan TM bitkisinin, TMV’ye karşı dirençli olduğu saptanmıştır. • Benzer kılıf proteini aracılığı ile koruma mekanizması salatalık mozaik virüsü ve patates virüsü gibi çeşitli bir dizi virüs için rapor edilmiştir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Viral hastalıklara direnç • Hawaii’de papaya ekonomik önem açısından ikinci sırada yer almaktadır. Bu ürün, papaya ring spot virüsü (PRSV) tarafından enfekte edilmektedir. 1998 yılında PRSV kılıf proteininin ifade edildiği transgenik papaya kültüvarları papaya endüstrisini ekonomik zarara uğramaktan kurtarmıştır. • Son yıllarda transgenik bitkiler viral proteinleri ya da RNA’ları kodlayan dizileri içerecek şekilde genetik mühendisliği teknikleri ile düzenlenerek virüslere karşı direnç kazanmaları sağlanmaktadır.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Azot fiksasyonu • Soya fasulyesi gibi ekonomik açıdan büyük öneme sahip bitkilerin dahil olduğu baklagiller Rhizobium, Bradyrhizobium ve Frankia gibi atmosferik azotu fiske eden türler ile simbiyotik formlar oluştururlar. • Serbest yaşayan rhizobia toprakta bulunur. • Bakteriler tarafından konak bitkilerin doğal enfeksiyonu sonucunda Rhizobium’un içinde çoğaldığı kök yapısında nodül oluşur. • Azot gübresi ihtiyacını azaltmak için yaklaşık 100 yıldır ticari olarak üretilen rhizobia’nın baklagillere aşılanması çalışmaları devam etmektedir. • Bu uygulamanın hiçbir olumsuz etkisi belirlenmemiştir. Sonuç olarak, genetik olarak değiştirilmiş rhizobia suşlarının büyük ölçekli uygulamalarında olumsuzlukların gözlenmesi beklenmemektedir.

TARIM ZORLU ÇEVRESEL KOŞULLARA ADAPTASYON Azot fiksasyonu • Azot fiksasyonu için önemli olan genler aktarılmak suretiyle genetik olarak düzenlenmiş Bradyrhizobium japonicum ve Rhizobium meliloti suşları, doğal tip suşlara kıyasla sera koşullarında konak bitkilerinde daha fazla biyokütle artışı sergilemişlerdir. • Toprakta serbest yaşayan rhizobium türleri, oldukça fazla miktarda bulunduğundan rekabetin üstesinden gelebilmek için genetik olarak düzenlenmiş yeni suşlar toprağa fazla miktarlarda eklenmelidir. • Bu durum yüksek inokülasyon maliyetine neden olacaktır. • Rhizobiumlar üzerinde yürütülen, rekabet sırasındaki biyokimyasal değişiklikler ve enfeksiyon mekanizmalarının aydınlatılması çalışmaları, bu zorlukların aşılmasına yardımcı olacaktır. • Tarımda mikrobiyal biyoteknolojinin ilerleyişi, azot fiksasyonunun oldukça pahalıya mal oluşu ve pestisitlerin yaygın kullanımının artık mümkün olamayacağından dolayı hız kazanmıştır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Fermente gıdaların hazırlanması • Mayalı gıdaların üretiminde mikroorganizmaların kullanımı oldukça eski dönemlere dayanmaktadır. Bira, şarap, tereyağı, zeytin, salam, lahana turşusu ve daha pek çok gıdanın üretimi için mikrobiyal fermentasyon gereklidir. • Mikroorganizmalar tarafından üretilen metabolik son ürünler, fermente gıdalara lezzet verirler. • Örneğin; olgunlaşmış kalıp peynirler özgün aromalarını mantarlar tarafından üretilen aldehitler, ketonlar ve kısa zincirli yağ asidi karışımlarına borçludurlar.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Fermente gıdaların hazırlanması • Laktik asit bakterileri fermente gıdaların üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. • Bu organizmalar ayrıca gıda bozulmasına neden olan istenmeyen organizmaların gelişimini inhibe eden peptitler ve proteinler (bakteriyosinler) üretmeleri nedeniyle gıda fermentasyon endüstrisinde öneme sahiptirler.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ NİSİN • Nisin; L. lactis tarafından üretilen bir antimikrobiyal peptittir ve ısıl işlem uygulanan ve düşük p. H’ya sahip gıdalara düşük konsantrasyonda ilave edilen (son üründe 250 ppm olacak kadar) yaygın kullanıma sahip bir koruyucudur. • Nisin; Listeria, Clostridium, Bacillus ve enterokokların dahil olduğu geniş bir Gram pozitif bakteri grubuna karşı etkiliyken; Gram negatif bakterilere, mayalara ve küflere karşı etki göstermez.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ NİSİN • Nisin, antimikrobiyal aktivitesini bakteri sitoplazmik membranının lipid II yapısına yüksek afinite ile bağlanması sonucu por yapısı oluşturmak suretiyle gösterir. • Nisin ABD’ de ve dünyadaki pek çok ülkede GRAS yani «Gıda Katkı Maddesi Olarak Genellikle Güvenli» olarak nitelendirilmektedir. Pastörize peynirler başta olmak üzere; soslar, sıvı yumurta ürünleri, bazı konserve gıdalar, dondurulmuş tatlılar gibi pek çok gıdanın içerisine eklenir.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Lactobacillus sakei : Umut vaad eden bir biyokoruyucu • Psikrofil bir bakteri olan L. sakei, ilk olarak laktik asitin kısmi fermentasyonu ile üretilen Japon birası sakeden izole edilmiştir. • L. sakei suşları salam ve diğer fermente etlerin üretiminde spontan fermentasyona hakim flora olarak bulunmaktadır. • Bu gibi organizma türleri ayrıca soğuk derecelerde muhafaza edilen işlenmiş gıda ürünlerinin mikrobiyal florasının ana elemanını oluşturmaktadır. • L. sakei starter kültürlerinin patojen ve gıda bozulma etmeni organizmaların gelişimini önlediği bilinmektedir ve fermente gıdaların üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. L. sakei ayrıca insan bağırsak florasının geçici bir üyesidir.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Lactobacillus sakei : Umut vaad eden bir biyokoruyucu • Lactobacillus acidophilus’un da dahil olduğu diğer bir dizi laktik asit bakterisi, insan bağırsak sisteminin geçici ya da kalıcı üyesidir. • Bağırsak sisteminde, belirtilen bu organizmalar probiyotik türler olarak adlandırılır ve immün yanıt oluşturmanın yanı sıra potansiyel patojen bakterilerin gelişmesini baskılarlar. • Son zamanlarda yapılan bir çalışmada Fransız sucuğundan izole edilen L. sakei 23 K suşunun dizi analizi gerçekleştirilmiş ve Lactobacillus acidophilus genomu ile %43 oranında benzer bulunmuştur. • Daha önce belirtilen çeşitli nedenlerden dolayı güvenli bakterilerin biyokoruyucu olarak kullanımı büyük ilgi görmektedir ve L. sakei buna mükemmel bir adaydır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Lactobacillus sakei : Umut vaad eden bir biyokoruyucu • L. sakei 23 K tüm genom dizisinin biliniyor olması, bu organizmanın taze et üzerinde gelişmesi, fermentasyon ve depolama sırasında karşılaştığı sorunların aydınlatılmasını sağlar. • Bu zorlu koşullar; • yüksek düzeyde oksidatif stres, • yüksek tuz konsantrasyonu • düşük sıcaklığı kapsar. • L. sakei 23 K genomu; bu organizmanın et üzerinde bulunan kollajene bağlanma ve hücre-hücre etkileşimlerinde rol alan 4 adet protein kodlamaktadır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Lactobacillus sakei : Umut vaad eden bir biyokoruyucu • Bu proteinler diğer Lactobacillus türlerinde bulunmamaktadır. • Diğer iki gen kümesi bakterinin et yüzeyine tutunmasında rol aldığı düşünülen yüzey polisakkaritleri üretmektedir. • Bu protein ve polisakkarit yüzey bileşenleri L. sakei 23 K’nın et yüzeyine agregasyonu ve diğer mikroorganizmaların da dahil olduğu biyofilm yapılarının oluşmasına aracılık etmektedir.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Lactobacillus sakei : Umut vaad eden bir biyokoruyucu • Etin depolanma koşulları sıklıkla soğuğu ve tuzu (%9 Na. Cl) gerektirmektedir. • L. sakei osmotik stres ve sıcaklığın her ikisine de adapte olmuştur. • Diğer Lactobacillus türleri ile kıyaslandığında çok daha fazla sayıda soğuk stresine direnç proteinini sahiptirler. • L. sakei ayrıca etin işlenmesi sırasında açığa çıkan süperoksit ya da reaktif oksijen türlerini detoksifiye edecek enzimler ile donatılmıştır. • Son olara L. sakei ‘nin etten hem ve demirin her ikisini de alması gerekmektedir. • L. sakei ‘nin demir kullanımı için etin üzerindeki diğer mikroorganizmalar ile rekabet etmesi gerekliliği önemli bir diğer noktadır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ MONENSİN • Ruminantların beslenmesinde yem katkı maddesi olarak iyonoforlardan önemli ölçüde yararlanılmaktadır. • İyonoforların en önemlilerini monensin, lasalocid ve salinomycin oluşturmaktadır. • Bu maddeler, rumende meydana gelen olayları ya doğrudan doğruya yada bazı aksaklıkları önleyerek düzenlemektedirler. • Böylece; • 1)sindirim olaylarının düzenli seyrini, • 2)yemden yararlanmanın iyileşmesini ve • 3)canlı ağırlık artışının hızlanmasını sağlamaktadırlar. • İyonoforların etki mekanizmaları tam olarak bilinmemekle birlikte, rumen mikroflorasını etkileyerek propiyonik asit oranını artırdığı, asetik asit ve amonyak oranını düşürdüğü belirtilmektedir. • Bu maddeler aynı zamanda Na, P, Mg, K ve Zn absorpsiyonunu da artırabilmektedirler.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ MONENSİN • İyonoforlar, ilk olarak 1950’li yılların başında izole edilmiştir. • İlk izole edilen iyonofor monensindir. Monensinin yapısı ancak 1967 yılında tanımlanabilmiştir. • Çalışmalar, monensinin ruminal fermentasyonu değiştirerek yemden yararlanmayı iyileştirdiğini göstermiştir. • Ruminantların beslenmesinde gelişmeyi teşvik edici madde olarak kullanılan iyonoforlar, karboksilik yapıda bileşiklerdir. • Monovalent ve divalent katyonlarla bileşik oluştururlar ve bu katyonların hücre membranından içeri girişini katalize ederler.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ MONENSİN • İyonoforların büyük çoğunluğu monovalent katyonlarla bileşik oluşturabilmektedir. • Lasalocid, lysocellin ve tetronasin ise, monovalent katyonlara ek olarak divalent katyonlarla da bileşik oluşturabilmektedirler. • İyonoforların, etki mekanizmalarının tam olarak bilinmemesine rağmen, pek çok etki mekanizmasına sahip olduğu da bildirilmektedir. • En önemli etki mekanizmaları ruminal, antimikrobiyal ve postruminal mekanizmalardır. Buna ilaveten, iyonoforların mineral madde emilimi üzerine de önemli düzeyde etkileri bulunmaktadır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ TEK HÜCRE PROTEİNi • Tek hücre proteini ya da kısaca “SCP” terimi, hayvan ya da insan tüketimi için büyük ölçekli mikroorganizma gelişimi sonucu ede edilen proteince zengin kütleyi ifade eder. • SCP, tüm esansiyel amino asitlerin bulunduğu yüksek protein içeriğine sahiptir. • Mikroorganizmalar; • hızlı gelişimleri, • karbon kaynağı olarak oldukça ucuz hammadde kullanımları ve • kilogram hammadde başına gram ile ifade edilecek düzeyde protein üretmeleri nedeni ile mükemmel bir SCP kaynağıdır. • Bu avantajlarına karşın yalnızca bir SCP, insan tüketimi için pazara kadar ulaşabilmiştir. Bu ürün “mycoprotein” dir ve Fusarium venetatum adındaki filamentöz fungusun hücre kütlesinin işlenmesi sonucunda üretilmiştir.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ TEK HÜCRELİ PROTEİNİ • Fusarium venetatum PTA-2684 suşu ilk defa İngilterede Buckinghamshire’dan alınan toprak örneğinden izole edilmiştir. • Marlow Foods Ltd. F. venetatum suşunu, dünya genelinde farklı yerlerden izole edilen 3000 suş arasından seçmiştir. • Üretim sürecinde mycoprotein, içerisinde mantar hücrelerinin son ürünlerinden gelecek istenmeyen maddelerin olmamasına özen gösterilerek tasarlanmıştır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ TEK HÜCRELİ PROTEİNİ • F. venetatum sürekli kültür koşullarında geliştirilmiştir yani havalandırmalı koşullar altında ortama sürekli taze besin maddesi eklenirken oluşan artık maddeler uzaklaştırılmıştır. • Bu fermentasyon koşulları, toksik mycotoksinlerden kaçınmak için seçilmiştir. • Fusarium cinsi üyeleri; • sınırlı besin miktarı, • düşük oksijen konsantrasyonu gibi zorlu koşullarda çeşitli mycotoksinler üretirler. Mycotoksin sentezinden kaçınmak (korunmak) için suşlar, hiçbir besin sınırlaması olmaksızın yüksek miktarlarda üretilirler. Kültürler; tek karbon kaynağı olarak glukozun bulunduğu, kimyasal olarak tanımlanmış ve besinsel olarak dengelenmiş ortamlarda geliştirilirler. Ortam içeriği, suşa saatte en az 0. 17 oranında büyümeye olanak sağlayacak şekilde ayarlanmıştır. Mycotoksin oranlarının belirlenebilmesi için son ürün, kütle spektrometrisi ile incelenir.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ TEK HÜCRELİ PROTEİNİ • Hızlı büyüyen bakteri ve mantar hücreleri RNA bakımından zengindir. • Beslenme sırasında alınan RNA, pürin ve pirimidinlere yıkılır. Pürinler ürik asite parçalanırlar. • Ürik asit miktarındaki artış gut ve böbrekte taş oluşumu riski doğurur. • Bu problemle karşılaşılmasının önüne geçmek için United Nations Protein Advisor Group 1972 yılında insan tüketimine sunulan SCP’lerin günlük alımının 2 g RNA içeriğinden fazla olmaması gerektiğini vurgulamaktadır.

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ TEK HÜCRELİ PROTEİNİ • Fungal biyokütleyi içeren fermentasyon sıvısı, buhar enjeksiyonu sureti ile hızla ısıtılır. • Hızlı ısıtma aşaması hücrelerin ölümüne neden olur. Beraberinde RNA degredasyonu da gerçekleşir. • Ardından, fermentasyon sıvısı santrifüj işlemine tabi tutulur. Hücrelerin çökmesi sağlanırken, RNA degredasyonu ile açığa çıkan ürünler de süpernatant ile atılmış olur. Bu uygulamalar, hücre kütlesindeki RNA miktarında %10 azalmaya neden olur. • Hayvan denemeleri sonucunda mycoproteinlerin kronik toksisiteye neden olmadığı, tekrarlanabilir toksikan olmadığını ve teratojen ya da karsinojen olmadığını göstermiştir. • Kalsiyum, iyon ya da diğer önemli inorganik maddelerin alımını engellemezler. • Marlow Foods Ltd. yaptığı açıklamada mycoproteinin yer fıstığı ve deniz ürünleri gibi pek çok gıdadan daha az alerjenik olduğunu ifade etmiştir.

MİKROORGANİZMALARIN ÇEVRESEL UYGULAMALARI ATIK SU İYİLEŞTİRMESİ Canlı organizmaların yaklaşık %70’i sudan oluşmaktadır. Örneğin insanoğlu hayatta kalabilmek için günde ortalama 1. 5 litre su tüketmelidir. Tatlı su kaynakları, dünyadaki suların yalnızca %2. 5’ini oluşturur. Bu oran dünyanın bazı yerlerinde ise yok denecek kadar aza düşmektedir. Popülasyonun ve endüstriyel kullanımın artışına bağlı olarak kontamine olan ve geri temizlenmesi gereken su miktarı artış göstermektedir. • Atık sular temelde 4 kaynaktan türemektedir: • • • kanalizasyon, endüstriyel atıklar, tarımsal ve kentsel atıklar Atık suların temizlenmesi içme suyunun kontaminasyonunun ve besin zincirine patojenlerin ve kontaminantların girişinin önlenmesi açısından önemlidir.

Bİyoremedİasyon Nedİr? • Çevredeki kimyasalları parçalamak veya ayrıştırmak için bakteriler, mantarlar ve bitkiler gibi yaşayan organizmaların kullanılmasıdır. 33

Bİyoremedİasyon Neden Önemlİdİr? • İnsanların yaşam kalitesi ne kadar temiz ve sağlıklı bir çevrede yaşadığıyla doğrudan ilgilidir. 34