Alkoholna fermentacija Alkoholno vrenje ire 1 Alkoholna fermentacija

Alkoholna fermentacija Alkoholno vrenje šire 1

Alkoholna fermentacija je proces u kome se odigravaju vrlo složene i duboke biohemijske promene pri kojima se razlaže šećer uz obrazovanje etil-alkohola i ugljendioksida kao glavnih proizvoda i još nekih sekundarnih proizvoda više ili manji važnih za kvalitet vina. Delujući preko raznih fermenata kvasac je nosilac svih ovih reakcija, koje predstavljaju manifestaciju njegovih životnih funkcija pod određenim uslovima. 2

Alkoholna fermentacija Predstavlja jednu od osnovnih faza u procesu proizvodnje vina. Vrenjem šire, ili kljuka u stvari, počinje stvaranje vina. To je faza koja nastupa nakon muljanja grožđa odnosno cijeđenja šire. Tada kvasci (gljivice alkoholne fermentacije) koji su na pokožici bobice mirovali, došavši u tečnost u kojoj je rastvoren šećer (u širu), počinju intenzivno razmnožavanje, razlažući šećer na razna jedinjenja, a najviše na alkohol i CO 2. Ova dva jedinjenja su, u stvari, najvažniji i osnovni produkti rada vinskog kvasca. i 3

Promjene u širi koje izazivaju kvasci vizualno se ogleda u sljedećem: l šira se najprije jako zamuti, l zatim se stvaraju lagani mjehurići i pojavljuje se debela pjena koja počinje vreti. l temperatura poraste za 10, 20 i više stepeni i Ovaj proces i promjene nazivaju se alkoholno vrenje šire ili alkoholna fermentacija, odnosno vinifikacija u užem smislu riječi. 4

Poznato je da u šira prilikom muljanja grožđa zajedno s poželjnim vinskim kvascima dolazi i mnoštvo drugih nepoželjnih kvasaca i raznih štetnih mikroorganizama. Tako, pored alkoholne fermentacije postoji i - sirćetna, - mliječna, - buterna i druge fermentacije. Međutim, za proizvodnju vina je najbitnija alkoholna fermentacija, u kojoj groždjani sok, šira, prelazi u vino, dok se neke od ostalih pomenutih fermentacija pojavljuju u procesu kvarenja vina pod uticajem štetnih mikroorganizama. 5

Zavisno od uslova u kojima se nalaze (uslovima pod kojim se odvija alkoholna fermentacija) i sami kvasci se različito ponašaju, → stvarajući više ili manje alkohola, → ugljen dioksida, → glicerina, → sirćetne kiseline 6

Pod uticajem nepoželjnih činilaca može doći do prekida vrenja, alkoholne fermetnacije l l l Šira od trulog grožđa teško prevrire i lako prekida vrenje ako se ne poduzmu odgovarajuće mjere (jače sumporenje, taloženje šire ili pasterizacija uz upotrebu selekcioniranih kvasaca). Do prekida vrenja dolazi, takođe, i pri visokim temperaturama. Prekid vrenja će potencirati nepoželjan sastav šire, na primjer visoka koncentracija šećera, nedovoljan sadržaj kiselina, visok sadržaj SO 2, CO 2 itd. 7

Da li će se fermentacija odnosno vrenje šire pod uticajem plemenitih sojeva vinskog kvasca odvijati pravilno? Ili će vrenje pod uticajem nepoželjnih mikroorganizama krenuti u neželjenom pravcu? Zavisi od toga da li su u širi stvoreni uslovi koji pogoduju vinskom kvascu, koji su specifični za svaki konkretni slučaj. 8

Kvasci kao uzročnici alkoholne fermentacije 9

Kvasci kao uzročnici alkoholne fermentacije 10

Saccharomyces ellipsoideus l l Najzastupljeniji u širi i imaju primarnu ulogu u procesu alkoholne fermentacije šire i kljuka. Smatra se da su oni najbolje prilagođeni širi kao supstratu za svoje razviće i da im je to najpovoljnija prirodna sredina. Ovi kvasci su sposobni da alkoholnu fermentciju šire obave do kraja i daju vina dobra kvaliteta. Sposobni su da stvore visok procenat alkohola u vinu, a neki sojevi mogu stvarati i do 17 vol% alkohola. Među kvascima Sacch. ellipsoideus u prirodi se nalazi mnoštvo sojeva i rasa i oni se međusobno mogu razlikovati pojedinim osobinama: ¬ intenzitetom alkoholne fermentacije (dinamikom vrenja), ¬ količinom stvorenog alkohola, glicerina i isparljivih kiselina u vinu, ¬ otpornošću prema visokim i niskim temperaturama, ¬ otpornošću na sumpor-dioksid, ¬ brzinom taloženja po završetku vrenja, ¬ karakterom taloga, koji se stvara i dr. 11

Pored kvasca Sacch. ellipsoideus u širi se mogu naći i druge vrste kvasaca iz roda Saccharomyces među kojima su značajnije - Sach. oviformis, - Sacch. acidifaciens, - Sacch. chevalieri i dr. Ove vrste kvasaca iz roda Saccharomyces znatno su manje zastupljene u širi u toku alkoholne fermentacije nego kvasci Sacch. ellipsoideus. I oni se odlikuju relativno dobrim sposobnostima fermentacije šire, a neki od njih su izrazito velike energije vrenja, ali je njihova zastupljenost u širi znatno manja. Za kvasac Sacch. ellipsoideus može se reći da su vinski kvasci u užem smislu riječi, dok ostale pomenute vrste predstavljaju vinske kvasce u širem smislu. 12

U širi treba posebno istaći kvasce Sach. oviformis, jer su poslije kvasca Sacch. ellipsoideus najvažniji za alkoholnu fermentaciju šire. ü ü ü zastupljeniji su u poslednoj fazi fermentacije šire naročito se ističu stvaranjem visokog procenta alkohola u vinu, i do 18% alkohola, bitni u završnoj fazi fermentacije šire s visokim procentom šećera. najčešće su uzročnici naknadne fermentacije vina s većom ili manjom količinom nepreverlog šećera. Najzad, imaju izrazito veliku energiju vrenja, previru veliku količinu šećera, u jedinici vremena, a otporni su i na visoke koncentarcije sumpor-dioksida. 13

U širi se mogu naći i kvasci iz drugih rodova kao što su Kloeckera, Torulopsis i dr. Ovi kvasci, l stvaraju malo alkohola, l nijesu sposobni da dovrše alkoholnu fermentaciju šire. l neki od njih stvaraju veliku količinu isparljivih kiselina i druge sastojke koji nepovoljno utiču na ukus i miris vina. Zato što su nepoželjni, jer su negativni po kvalitet vina, često se nazivaju divljim kvascima. Među njima treba posebno istaći vrstu Kloeckera apiculata koja se srijeće u početku vrenja šire. U toj fazi oni ponekad mogu biti zastupljeni u istoj ili većoj mjeri nego i sami kvasci Sacch. ellipsodeus, jer se brže od njih razmnožavaju. Kvasci kloeckera apiculata su najčešće nešto izdužena i limunasta oblika sa zašiljenim polovima. Njihove ćelije su 14 znatno manje veličine od ćelije kvasca Sacch. ellipsoides. I

Stadijumi razvoja vinskog kvasca Vinski kvasci prolaze u svom razviću za vrijeme alkoholne fermentacije šire i kljuka kroz nekoliko stadijuma. To su: l Razmnožavanje, l Intenzivno vrenje, l Gladovanje, l Izumiranje, l Razlaganje (autoliza). 15

Stadijum razmnožavanja Vinski kvasci, koji prelaze iz groždja u širu, vrlo brzo se razmnožavaju u njoj, jer je šira za to vrlo pogodna hranljiva sredina. Brzina razmnožavanja kvasaca zavisi od hemijskog sastava i temperature šire. U bistroj širi se stadijum razmnožavanja vinskog kvasca može zapaziti po tome što šira počinje da se muti, a to mućenje je posledica uvećanja broja kvasaca u njoj. l Za razmnožavanje kvasca je naročito povoljno prisustvo veće količine kiseonika iz vazduha u širi i optimalna temperatura. Šira odmah poslije cijedjenja sadrži dosta ovog kiseonika koji je apsorbovala u toku muljanja groždja i cijedjenja kljuka. l Optimalna temperatura za razmnožavanje i aktivnost vinskog kvasca kreće se između 25 do 28 o. C. Veća količina kiseonika iz vazduha u širi se može dobiti pretakanjem šire na vazduhu, pa se to u praksi često primjenjuje za ubrzanje raznožavanja vinskog kvasca prije početka 16 vrenja.

17

Stadijum burne fermentacije Posle intenzivnog razmnožavanja u prisustvu vazduha, kada dođe pod anaerobne uslove i prelazi na razlaganje šećera putem alkoholne fermentacije i tom prilikom iz šećera nastaju alkohol i ugljen-dioksid. I u ovom procesu se oslobadja biološka energije, ali je količina energije sada znatno manja od one koja se dobija potpunom oksidacijom šećera do ugljen-dioksida i vode. Zbog toga je, da bi dobio potrebnu količinu energije prinuđen da razlaže velike količine šećera. Na taj se način može objasniti zašto je alkoholna fermentacija buran i energičan proces. U toku same fermentacije kvasci se slabo razmnožavaju, jer je ceo proces usmjeren na intenzivno razlaganje šećera, pa je otuda ovaj stadijum označen kao stadijum intenzivnog vrenja za kojeg se u ćelijama kvasca nakuplja dosta rezervnih hranljivih materija u obliku glikogena. 18

Stadijum gladovanja Kada se alkoholna fermentacija šire završi dobija se vino bez šećera, a vinski kvasac se nađe u supstartu koji je nepovoljan za njegovo održavanje i aktivnost. U nedostatku šećera kvasac je prinuđen da razlaže svoje sopstvene rezervne hranljive materije koje je akumulirao u ćelijama tokom vrenja. Stadijum gladovanja se upravo i karakteriše razlaganjem rezervnih hranljivih materija u ćelijama vinskog kvaca. I Razlaganje rezervnih hranljivih materija u ćelijama nastaje kada se one nalaze u vinskom talogu koji se stvorio po završenom vrenju. Ali, ovim razlaganjem rezervnih hranljivih materija ćelije vinskog kvasca ne izumiru brzo, jer se mogu uvijek lako oporaviti i nastaviti razmnožavanje i aktivnost ukoliko se ponovo ostave u povoljne uslove, to jest u sredinu koja sadrži šećer i druge hranljive materije. 19

Stadijum izumiranja i autolize kvasca Ako stadijum gladovanja traje duže dolazi do izumiranja i razlaganja (autolize) ćelije kvasca. Smrt ćelija se manifestuje odvajanjem protoplazme od ćelijske opne i povlačenjem u unutrašnjost ćelije, što se može ustanoviti mikroskopom. Poslije izumiranja može doći i do autolize ćelije kvasca. U toku autolize razlažu se svi sastojci ćelijske protoplazme, i budući su rastvorljivi, prelaze u vino. Pri tome je najznačajnije: l razlaganje bjelančevina do amino-kiselina i drugih rastvorljivih azotnih materija, l zatim razlaganje masnih materija i drugih sastojaka protoplazme. l U toku autolize oslobadjaju se i prelaze u vino i razni vitamini i druge biološke aktivne materije koje su se nalazile u ćelijama kvasca. Autolizom kvasca vino se obogaćuje lakopristupačnim N hranljivim materijama i vitaminima, te postoje pogodna podloga za razvoj nekih štetnih mikroorganizama koji izazivaju kvarenje vina. Najčešće se, ako im i ostali uslovi odgovaraju, mogu razviti mliječne bakterije. 20

Oksidativni stadijum Pored navedenih i opisanih stadijuma razvića vinskog kvasca, neki sojevi kvasaca Sacch. oviformis mogu imati i tzv. oksidativni stadijum, koji se manifestuje na taj način što po završetku alkoholne fermentacije šire ćelije nastavljaju svoje razmnožavanje i aktivnost, stvarajući na površini vina navlaku. Kvasci sa ovim osobinama su poznati kao šeri kvasci. U ovom oksidativnom stadijumu kvasci u prisustvu kiseonika iz vazduha razlažu neke sastojke vina, prvenstveno alkohol i glicerin, te na taj način stiču potrebnu biološku energiju za svoj razvoj. Osim toga, oni oksidišu i ispraljive kiseline te se one u vinu smanjuju. Kao posledica oksidacije alkohola stvara se velika količina acetaldehida, te vino dobija izrazit miris na acetaldehid. Osim toga, u ovome stadijumu kvasci stvaraju i druge materije aromatične 21 prirode – estre, acetale i dr.

Stadijum obrazovanja spora Ako se nađu u nepovoljnim uslovima, tj. ako nedostaje hranljivih materija, ćelije kvasca tada stvaraju spore. Kvasci se pomoću spora godinama održavaju u prirodnoj sredini u vinogradarskom zemljištu, podrumskim prostorijama, vinskim sudovima, podrumskoj opremi itd. Spore su otporne prema nepovoljnim spoljnim uticajima – ekstremnim temperaturama, nedostatku vlage idr. Ćelija vinskog kvasca stvara najčešće 3 -4 spore koje su okrugle i glatke površine. Po završetku stvaranja spora ćelijska opna (askus) prska i spore izlaze napolje, te u povoljnim uslovima mogu da klijaju u nove ćelije. 22

Hemijski procesi i tok alkoholnog vrenja - fermentacije 23

Hemizam alkoholne fermenacija i Kvasac koristi energiju iz šire (šećera) putem respiracije (disanja) i fermentacije. Za tehnologiju vina obje reakcije su podjednako značajne. Disanjem kvasac razlaže šećer u prisustvu vazdušnog kiseonika i to koristi prilikom svog razmnožavanja. Pri fermentaciji koja se odvija bez prisustva vazduha kvasac koristi samo šećer i energiju. 1. Disanje (uz prisustvo vazduha, aerobna) C 6 H 12 O 6 = 6 CO 2 + 6 H 2 O + 673 cal. 2. Fermentacija (bez prisustva vazduha, anaerobna) C 6 H 12 O 6 = 2 C 2 H 5 OH+ CO 2 + 33 cal. I Prva faza nastupa uglavnom prije i u početku alkoholne fermentacije, a druga faza nastupa i nastavlja se poslije, tj. kad su se kvasci razmnožili i kad su šira i vinska posuda prezasićeni ugljen dioksidom, uslijed čega su praktično stvoreni anaerobni uslovi za kvasce. U takvim uslovima, kvasci, da bi osigurali sebi potrebnu energiju za život, moraju razgraditi puno veće količine šećera. 24 Ova činjenica je značajna za alkoholnu fermentaciju i njen ekonomski efekt.

Proizvodi koji nastaju u procesu alkoholne fermentacije 25

Etil-alkohol nastaje kao krajnji proizvod transformacije šećera, a do te transformacije dolazi prema šemi Emden-Mayerhof-Parnas-a u nekoliko faza i to: 1. 2. 3. Molekul šećera se aktiviše vezivanjem s fofornom kiselinom: jedan molekul šećera se fosforiše sa dva modela fosforne kiseline: C 6 HH C PO =H 410 O 6·( 12+ 3 O 6 H 2 PO 3)2 + 2 H 2 O Aktivisani molekul šećera postaje hemijski labilan i odmah se razlaže na dvije trioze: 2 C 3 H 5 O 3·( H 2 PO 3) Jedna od ovih trioza je fosfor-glicerinski aldehid, a druga fosfor-dioksiaceton izomerizacijom, takodje, prelazi u fosfor-glicerinski aldehid. Fosfor-glicerinski aldehid se oksidiše u fosfor-glicerinsku kiselinu (CH 2 O· H 2 PO 3·CHOH·COOH) 26

4. 5. 6. U fazi fosfor-glicerinske kiseline hidrolizom se odvaja fosforna kiselina i ostaje glicerinska kiselina. U glicerinskoj kiselini dolazi do razmještanja pojedinih grupa u molekulu, izdvoji se jedan molekul vode, te glicerinska kiselina prelazi u priogroždjansku kiselinu: CH 3·CO·COOH Pirogroždjana kiselina podliježe dekorboksilaciji, pri čemu nastaje acetaldehid i ugljen-dioksid CH 3·CO·COOH= CH 3 COH + CO 2 Acetaldehid uz učešće vodonika redukuje se u etil-alkohol: CH 3 COH + 2 H= CH 3 CH 2 OH Kao što se vidi, acetaldehid nastaje poslije niza međuproizvoda u procesu transformacije šećera, a njegovom redukcijom 27 nastaje etil-alkohol kao poslednja faza ove transformacije.

l Ugljen dioksid (CO 2) To je drugi po količini proizvod alkoholne fermentacije. U zavisnosti od soja kvasca nastaje 0, 4 – 0, 5 g CO 2 po gramu degradiranog šećera. Ovde su interesantna 2 oblika: molekularni (CO 2) i bikarbonat (HCO 3 -). Dokazano je da parcijelni pritisak CO 2 od 0, 15 – 0, 2 atmosfere ne utiče na funkcionisanje kvasca i da se pritisku iznad ove vrednosti usporava razviće i metabolička aktivnost kvasaca. l Glicerin kao sporedan proizvod alkoholne fermentacije nastaje redukcijom glicerinskog aldehida, a glilcerinski aldehid je jedan od najvažnijih međuproizvoda dobijenih u procesu alkoholne fermentacije šećera u izvjesnom odnosu je s količinom stvorenog alkohola: na svakih 100 grama etil-alkohola stvara se 7 -14 grama glicerina. Glicerin se najvećim dijelom stvara u prvoj fazi vrenja, tj. kada je fermentacija najburnija, a kasnije je njegovo stvaranje sve slabije. i 28

Organske kiseline. U toku alkoholne fermentacije nastaje više od stotinak organskih kiselina i to preko 3 glavna puta metabolizma kvasaca: -Izvestan broj (acetat, sukcinat, a-ketoglutarat, malat i citrat) nastaje direktno od piruvata. Te kiseline mogu imati direktan uticaj na p. H i organoleptičke osobine vina. Među ovim kiselinama sukcinat, čiji sadržaj u vinu dostiže vrednost nižu od 1 g/l, predstavlja (pored glicerola) glavni sekundarni proizvod alkoholne fermentacije -Druge organske kiseline (izo-valerijanska i izo-buterna kiselina) nastaju u toku sinteze aminokiselina i viših alkohola. -Najzad, većina ostalih organskih kiselina nastaju u toku sinteze masnih kiselina preko malonil-Coenzim A. Te masne kiseline su konstitutivni elementi membrane ćelije kvasca. l 29

Nezasićene masne kiseline nastaju od zasićenih masnih kiselina reakcijama desaturacije zavisne od molekularnog kiseonika. Glavne masne kiseline koje stvaraju kvasci u toku fermentacije su: palmitinska (C 16: 0), palmitoleinska (C 16: 1), stearinska (C 18: 0) i oleinska (C 18: 1). Masne kiseline sa kraćim ugljeničnim lancem kao što su: kaproinska (C 6: 0), kaprilinska (C 8: 0) i kaprilna (C 10: 0) nastaju na isti način kao i predhodne, ali mogu da nastanu i kao proizvod oksidacije masnih kiselina sa dugim lancem. Sve te kiseline su prekursori za sintezu estera koji nastaju u toku alkoholne fermentacije. Većina ovih kiselina malo prelazi u spoljnu sredinu i uglavnom ostaju lokalizovane u ćeliji kvasca. One imaju značaj u toku nege vina na stelji i autolize kvasca. Ipak, neke masne kiseline sa kratkim lencem, zbog male dimenzije i jake hidrofobnosti, mogu da budu ekskretovane, pa neke od njih imaju ulogu autoinhibitora. 30

Isparljive kiseline nastaju i kao proizvod razlaganja šećera u toku alkoholne fermentacije. Među isparljivim kiselinama najznačajnija je sirćetna, jer od ukupne količine isparljivih kiselina na nju otpada 95 -99%. Sirćetna kiselina nastaje iz acetaldehida kao međuproizvoda u transformaciji šećera. Najveći deo acetaldehida redukuje se odmah po stvaranju u etil-alkohol. Međutim upored s ovim, mali deo acetaldehida podliježe oksidoredukciji uz učešće jednog molekula vode, pri čemu se od dva molekula acetaldehida jedan oksidiše u sirćetnu kiselilnu, a drugi redukuje u etil-alkohol: 2 CH 3 COH + H 2 O = CH 3 COOH + CH 3 CH 2 OH Na ovaj način vinski kvasac iz šećera stvara najčešće 0, 3 do 0, 8 grama po litru isparljivih kiselina što se smatra normalnom količinom isparljivih kiselina u vinu. Ukoliko je količina isparljivih kiselina u vinu iznad pomenute granice (0, 8 g po litru) postoji sumnja da su se u toku fermentacije ili tokom čuvanja vina aktivisale sirćetne bakterije koje iz alkohola stvaraju sirćetnu 31 kiselinu. i

Ćilibarna kiselina je redovan sastojak vina i nastaje kao sporedan proizvod u toku alkoholne fermentacije. Smatra se da se ona najvećim dijelom stvara iz glutaminske kiseline na taj način što vinski kvasci dezaminuju glutaminsku kiselinu. Izdvojeni amonijak kvasci koriste za sintezu bjelančevina ćelijske protoplazme, a ćilibarna kiselina ostaje u vinu. Butilenglikol kao sporedan proizvod vrenja, nastaje iz acetaldehida. Do stvaranja butlinglikola dolazi kondenzacijom dva molekula acetaldehida pri čemu se stvara acetilmetilkarbinol (aceton): CH 3 COH + CH 3 COH= CH 3 ·CO·CHOH· CH 3 Acetilmetil-karbinol se u prisustvu vodonika u anaerobnim uslovima odmah redukuje u butilenglikol: CH 3 ·CO·CHOH· CH 3 + 2 H = CH 3 CHOH· CH 3 Količina butilenglikola, koja nastaje u toku fermentacije, kreće 32 se od 0, 20 do 0, 5 grama po litru. i

Viši alkoholi Oni su u vinu zastupljeni u malim količinama, ali ih znatno više ima u vinskim destilatima. Među višim alkoholima pretežno su zastupljeni izoamil i izobutil-alkohol, dok su ostali viši alkoholi u vinu zastupljeni u veoma malim količinama ili u tragovima. U većini slučajeva odnos između ova dva alkohola je 3: 1 do 4: 1, u koristi izoamil alkohola. Ukupna količina pomenutih viših alkohola kreće se najčešće između 300 i 400 miligrama po litru vina. Crna vina sadrže nešto više ovih alkohola od bijelih. Prema prvobitnim tumačenjima viši alkoholi nastaju transformacijom odgovarajućih amino-kiselina u toku alkoholne fermentacije šire. Tako, na primjer, izoamilalkohol nastaje iz leucina, a izobutil-alkohol iz valina. Aminokiseline se transformišu reakcijom dezaminacjie, dekarboksikacije i redukcije, uz učešće fermenata vinskog 33 kvasca. i

Metil-alkohola (CH 3 OH) Stvara se u toku fermentacije šire, ali ne iz šećera, jer u njegovom stvaranju ne učestvuju fermenti vinskog kvasca, već nastaje hidrolizom pektinskih materija koju obavljaju odgovarajući pektolitički fermenti koji se redovno nalaze u groždju u širi. Šira uvijek sadrži izvjesnu količinu pektinskih materija koje su prešle sa čvrstih djelova grozda pri muljanju i cijedjenju šire. Otuda je količina metil-alkohola u bijelom vinu mala i kreće se od 50 do 80 miligrama po litru. Međutim, u proizvodnji crnih vina, od kojih do fermentacije dolazi u prisustvu čvrstih djelova grozda (pokožica i sjemenke), stvara se znatno veća količina metil-alkohola, jer hidroliza pektinskih materija u čvrstim djelovima grozda traje tokom cijelog perioda fermentacije kljuka 5 -7 dana. Količina metil-alkohola u crnom vinu obično iznosi 150 do 250 miligrama po litru. 34

Uticaj sastava šire na alkoholnu fermentaciju 35

Sastav šire Groždjani sok, šira, sadrži dovoljne količine svih hranljivih sastojaka koji su neophodni za porast i razmnožavanje vinskih kvasaca. Među najvažnije hranljive materije spadaju: l šećer, l azotne materije, l mineralne materije, l vitamini i druge biološke aktivne materija koje potiču iz groždja. Šećer služi kvascu kao izvor energije, dok azotne i mineralne materije ulaze u sastav ćelijske protoplazme. Ćelije kvasca mogu da korist samo materije koje su u rastvorljivom obliku. Hranljive materije uzimaju se kroz ćelijsku opnu osmozom. Od azotnih materija najvažnije su amino-kiseline, a od mineralnih P i K. Šira sadrži i vitamine, među kojima su za kvasac najvažniji tiamin (vitamin B 1), pantotenska kiselina i 36 biotin.

Količina šećera u širi može uticati na razmnožavanje vinskog kvasca i dinamiku fermentacije. Najčešće se količina šećera u širi kreće između 15 i 25%. Ove količine šećera ne usporavaju razmnožavanje kvasca i intenzitet fermentacije. Međutim, šira dobijena od prezrelog i uvenulog groždja (suvarak) može imati 30% i više šećera, te vrenje takve šire počinje nešto kasnije, teče sporije, duže traje i u vinu ostaje manje ili više nepreverlog šećera. U ovom slučaju usporavanje aktivnosti kvasaca ne dolazi samo zbog visoke koncentarcije šećera već i brzog visokog procenta alkohola koji se poslije odredjenog 37 vremena stvorio u širi bogatoj šećerom.

Kiselost šire i vina sačinjavaju razne organske kiseline, kao što su: vinska (COOH x CHOH x COOH ), jabučna (COOH x CH 2 x CHOH x COOH), limunska, mliječna, jantarna, sirćetna, ugljična i druge. Aktualna kiselost (p. H) vinskog kvasca kreće se od 4 - 6, a šire od 2, 8 - 3, 8. Veća kiselost šire ne šteti kvascima, ali zato šteti nekim nepoželjnim mikroorganizmima, naročito bakterijama. Kvasci su jako osjetljivi na sirćetnu kiselinu. Na primjer, sadržaj sirćetne kiseline oko 2 g/l otežava vrenje šire, a na 4 - 5 g/l vrenje prestaje. i Tanin (acidum tanicum) pri količini 3 g/l otežava fermentaciju, a pri sadržaju 6 g/l dolazi do zastoja i drugih težih poremećaja alkoholne fermentacije. Vinska i jabučna kiselina pogoduju vrenju ukoliko se nalaze u normalnim uslovima i količinama. Te dvije kiseline su donekle zaštitnici od nepoželjnog vrenja jer imaju neku vrstu selektivne uloge, tj. otežavaju rad nekih nepoželjnih bakterija i gljivica. i 38

Alkohol (CH 3 -CH 2 -OH), koji se stvara u toku fermentacije, nepovoljno utiče na aktivnost vinskog kvasca. - divlji kvasci bivaju inaktivisani već alkoholom koncentracije 5%, - slabije rase vinskog kvasca podnose 10 -12% alohola, - a najbolje rase biti aktivne i pri koncentraciji alkohola preko 15%. Naravno, povećanjem koncentarcije alkohola je i aktivnst dobrih rasa visnkog kvasca usporena, tako da se i fermentacija obavlja nešto sporije. U praksi se ponekad primjenjuje tzv. fermentacija iznad 4, tj. širi se prije početka vrenja dodaje 4 -5% alkohola da bi seo nemogući razvoj divljih kvasaca. I vinski kvasci se tada nešto sporije razmnožavaju i fermentacija kasnije počinje, ali u ovoj fazi fermentacije skoro isključivo učestvuje samo rase vinskog kvasca 39

Fenolna jedinjenja nalaze se u manjim količinama u širi ili vinu. Normalne količine ovih materija ne utiču nepovoljno na kvasce i fermentaciju šire. Veće količine, naročito u vidu taninskih i materija boje i ostalih polifenola, ometaju rad kvasaca, odnosno fermentaciju. Ovo se objašnjava time što se fenolni jedinjenja kao pozitivno nabijen koloid spajaju sa ćelijama kvasaca koje nose suprotno naelektrisanje i na taj način ometaju rad kvasaca. U vezi s tim utvrđeno je da 3 g/l taninskih materija čine neznatne smetnje u fermentaciji, dok je pri sadržaju 6 - 10 g/l poremećaj fermentacije znatan. 40

Ugljen dioksida (CO 2) Kvasci su osjetljivi na ugljen dioksid (CO 2). Dokazano da prisustvo ugljen dioksida već u količini od 0, 25 % usporava razmnožavanje kvasaca, potpuno onemogućava koncentracija ugljen dioksida od 15 g/1, što odgovara pritisku od 7, 7 atmosfera. Koncentracija ugljen dioksida ne utiču toliko na fermentaciju, jer zimaza kompleks enzimatski ostaje aktivan ako se koncentracija ugljen dioksida čak udvostruči. Tek pritisak od 30 atmosfera ubija kvasce. Koncentracija CO 2 danas se koristi takođe i za kontrolisanu fermentaciju šire (od 1 - 3 bara) i čuvanje vina od oksidacije u nedovoljno punim bačvama. 41

Sumpor-dioksid kao antiseptičko i fungicidno sredstvo takodje utiče na razmnožavanje kvasaca. Divlji kvasci i bakterije se brzo, inaktivišu i relativno malim količinama sumpor-dioksida u širi, dok su vinski kvasci dosta otporni na sumpor-dioksid. Pri slabijem sumporisanju šire (5 -10 g/hl sumpor-dioksida) ne dolazi do osjetnijeg ometanja razmnožavanja vinskog kvasca; tek se preko 10 g/hl sumpor-dioksida fermentacija počinje sa izvjesnim zakašnjenjem od 1 -2 dana. Treba naglasiti da pri jačem sumporisanju šire fermentracija zakašnjava više ili manje, ali kada počne obavlja se normalno i bez zastoja. U slučajevima jakog sumporisanja šire neophodno je širi dodavati selekcionisani vinski kvasac koji je otporan na sumpor-dioksid 42 (sulfitni kvasac).

Antibiotičke materije u širi utiču na razviće vinskog kvasca i dinamiku alkoholne fermentracije na različite načine. Plijesni, kao što su Penicillium expanzum i Penicillium glaucum, ponekad razvijaju jače na groždju i luče antibiotike koji prelaze u širu. U zavisnosti od količine ovih antibiotika – a ta količina zavisi od stepena razvoja ovih plijesni na groždju – dolazi do većeg ili manjeg usporavanja alkoholne fermentacije. Redje se dešava da zbog prisustva antibiotika dodje do većih usporavanja i prekida fermentacije. i 43

Razni hemijski preparati, fungicidi i insekticidi, koji se koriste za zaštitu vinove loze od bolesti i štetočina mogu dospijeti s groždjem u širu. Ako se nađu u većoj količini štetno utiču na razmnožavanje i aktivnost kvasaca. Ovdje su, uglavnom, u pitanju hemijski preparati Cu, As, S i razni organski preparati koji se u novije vrijeme upotrebljavaju. Veća kolčina ovih sredstava može se pojaviti u širi ako poslije njihove upotrebe ne bude jačih kiša koje ta sredstva speru s groždja. 44

Uticaj nekih ekoloških faktora na alkoholnu fermentaciju Tok alkoholne fermentacije prilično je komplikovan za onoga ko nije upoznat sa svim činiocima koji mogu uticati na njen tok, a to su uglavnom: l temperatura šire, l aerobni i anaerobni uslovi, l dnevna i druga svjetlost, l sastav mikroflore šire, l sadržaj CO 2, SO 2 i drugih antiseptika, l pritisak u bačvi i drugo. Svi ovi činioci alkoholne fermentacije su načelne prirode, ali istovremeno su i specifični za svaki poseban slučaj vinifikacije. i 45

Uticaj aerobnih uslova Aeracija šire znatno utiču na tok fermentacije jer je kiseonik potreban za razvoj i život kvasaca. Iako je alkoholna fermentacija anaerobni proces, i u teoriji i u praksi je utvrđeno da se ona puno brže, intenzivnije i sigurnije odvija uz prisustvo kiseonika. Pod strogo anaerobnim uslovima fermentacija je jako otežana i ne odvija se do kraja, tj. ostaje ne prevrelog šećera. Kiseonik (O 2) je naročito potreban u početku, dok se kvasci razmnože. U strogo anaerobnim uslovima izostaje razmnožavanje kvasaca. Ukoliko se u početku uočavaju određeni znaci razmnožavanja, to je samo u toku razvoja prvih nekoliko generacija, tj. dok u ocijeđenom širi postoje određene količine neutrošenog kiseonika. Kad se utroši i ovaj kiseonik, razmnožavanje prestaje, a s vremenom prestaje i fermentacija. 46

Uticaj aerobnih uslova Jača aeracija šire prije početka vrenja preporučuje se kada se: l vinski kvasac slabije razmnožava, pa to razmnožavanje treba pojačati, l za šire s visokim procentom šećera koji usporava i razmnožavanje kvasca i fermentaciju, l pri fermentisanju šire od prezrelog i uvenulog groždja (suvarak), l kada se zapazi da fermentacija prestaje, a u vinu još ostaje neprevrelog šećera, l pri izazivanju naknadnog vrenja u nepotpuno prevrelih vina primjenjuje se jača aeracija radi aktivisanja vinskog kvasca. Ukoliko prekid vrenja nestane usled niske temperature, vino i podrumske prostorije se zagrijavaju na 20 -25 Co, a potom se vrši aeracija pretakanjem na vazduhu. 47

Uticaj aerobnih uslova Savremena tehnologija ne preporučuje prozračivanje šire! S preradom šire (muljanje, cijeđenje, prenošenje šire, ocjeđivanje šire) dospijeva dovoljno kiseonika u šira za normalnu fermentaciju. Štoviše u novije vrijeme i ova količina se smanjuje preradom grožđa u atmosferi CO 2. Time se želi što više deaktivirati patogena aerobna grožđana mikroflora i enzimi oksidaze i smanjiti doza sumpora. Danas se nastoji spriječiti pristup vazduha za vrijeme fermentacije i za vrijeme formiranja vina. Poželjno je da fermentacija odmah krene (tj. da je tzv. predfermentativna faza što kraća), a da se fermentacija poslije toga odvija što ravnomjernije, što duže i pri nižim temperaturama. Burnu fermentaciju danas izbjegavamo, zbog porasta temperature i ostalih loših posljedica. Ukoliko se kvasac ne razmnožava u dovoljnoj mjeri i fermentacija zbog toga ne krene, što je često slučaj u širama s puno šećera, u takvim slučajevima se šira 48 prozračuje. i

Uticaj temperature Temperatura je veoma važan ekološki faktor koji utiče na razmnožavanje vinskog kvasca i dinamiku alkoholne fermentacije. Optimalna je temperatura za aktivnost vinskog kvasca 25 -28 Co. Kod fermentacije šira se zagrijeva oslobadjanjem toplotne energije, a zagrevanje šire je brže ukoliko je veća količina šire koja previre, na primjer, u velikim vinskim sudovima. U toku fermentacije temepratura šire može se povećati za 10 -15 Co i dostići vrijednost 30 -35 Co. Imajući u vidu povećanje temperature u toku fermentacije, temperatura šire prije početka ne treba da je iznad 15 -20 Co. Ukoliko je šira hladnija od 15 o treba je zagrejati do odgovarajuće temperature. 49

Temperatura je jedan od bitnih činioca početka i završetka alkoholne fermentacije, a u svezi s tim i njenog trajanja. 1. Da li će šira početi istog dana s fermentacijom ili nakon 8 i više dana? 2. Da li će završiti fermentaciju prije ili kasnije, ili će fermentaciju prekinuti? 3. Da li će kvasci stvoriti više ili manje alkohola? Zavisi mnogo i od temperature šire. Treba imati u vidu da su kvaščeve gljivice živi organizmi i da se prema tome uticaj temperature odražava na sve njihove životne funkcije. 50

Uticaj visoke temperature Vrlo visoka temperatura u toku fermentacije: - usporava aktivnost kvasaca usled čega - dolazi do usporavanja vrenja, pa i prekida. U takvim slučajevima često ostaje manja ili veća količina neprevrelog šećera. Aktivnost kvasca prestaje na temperaturi 38 do 40 Co, ali maksimalna tempetratura koju vinski kvasac može da podnese zavisi i od koncentracije alkohola u supstratu. Osim toga, na visokim temperaturama, u toku vrenja može doći do razvoja i aktivnosti štetnih bakterija, naročito sirćetnih i mliječnih, usled čega se vino može pokvariti u toku vrenja. Temperatura vrenja šire utiče i na količinu sastojaka koji nastaju razlaganjem šećera. Tako, na primjer, pri vrenju šire na višim temperaturama dobija se nešto manje alkohola, a više glicerina i isparljivih kiselina. U cilju ublaženja štetnih posledica pretjerano visokih ili vrlo niskih temperatura u toku vrenja korisno 51 je upotrijebiti selekcionisani vinski kvasac koji je otporan na visoke,

Uticaj temperature Imajući u vidu moguće štetne posledica usled jakog povišenja temperature u toku vrenja često se primjenjuje rashladjivanje šire kada temperature dostignu 30 -35 Co. Za hladjenje šire koriste se uredjaji u vidu zmijastih cijevi koje se stavljaju u bačve za vrenje da bi se kroz njih provodila hladna voda. l Fermentacija šire u čijoj fazi najburnijeg vrenja temepratura dostiže 30 Co često se zove topla fermentacija. Medjutim, u praksi se primjenjuje i tzv. hladna fermentacija u toku čijeg se cijelog perioda vrenja temperatura održava na 10 -15 Co. Za hladjenje šire koriste se uredjaji u vidu zmijastih cijevi koje se stavljaju u bačve za vrenje da bi se kroz njih provodila hladna voda. 52

Hladna fermentacija je znatno sporija i može da traje nekoliko nedelja i neophodna je upotreba selekcionisanog vinskog kvasca otpornog na niske temperature. Hladna fermentacija ima niz preimućstava za kvalitet vina nad toplom fermentacijom. Ta preimućstva se ogledaju u ovome: l vino sadrži više alkohola, a manje isparljivih kiselina; l za vrijeme vrenja dolazi do većeg taloženja streša, pa se dobija stabilnije vino; l vino je svježija ukusa usled veće količine ugljen-dioksida; l vino sadrži veću količinu sumpor-dioksida, jer su manji gubici sumpor-dioksida usled oksidacije i isparavanja u toku vrenja šire; l dobija se bistrije vino sa bolje izraženim vinskim ukusom i mirisom l vino od kvalitetnih i visokokvalitetnih sorta groždja ima znatno bolje izražene sortne karakteristike. i 53

Kvasci i ostala mikroflora Sastav mikroflore u širi bitan je element toka alkoholne fermentacije. Na grožđu, a zatim i u širi nalazi se mnoštvo raznih vrsta mikroorganizama, a među njima najviše gljivica alkoholnog vrenja, tj. vinskog kvasca. Svi oni različito se ponašaju u širi, pa prema tome i alkoholno vrenje šire se odvija različito, zavisno od sastava mikroflore šire. Ovi odnosi mogu biti različiti, kako između ukupnih kvasaca i drugih mikroorganizama u širi, tako i unutar, tj. pojedinačno između pojedinih vrsta kvasaca. Ti odnosi mogu biti takvi da prisustvo jednih potpomaže akciju drugih, i obratno. Tako je, na primjer, utvrđeno da se Sacc. ellipsoideus antagonistički odnosi prema Torulopsis bacilaris, tj. ometa razvoj istog, dok se Schizosacc. pombe, koji razlaže jabučnu kiselinu, isto odnosi prema bakterijama mliječne fermentacije. Međutim, utvrđeno je opet da prisustvo nekih kvasaca pospješuje rad ovih bakterija. 54

Primjena selekcionisanog kvasca 55

Primjena selekcionisanog kvasca U toku mjuljanja groždja i cijedjenja šire s groždja prelazi u širu raznovrsna mikroflora. Ukoliko u toku sazrevanja dodje do slabijeg ili jačeg truljenja groždja doći će i do jačeg razvića raznovrsne mikroflore groždja. U mikroflori se nalaze vinski kvasci, prvenstveno Sacc. ellipsoideus, kao i razne vrste divljih kvasaca. Osim toga, u širi se može naći dosta sirćetnih bakterija i raznih plijesni. Šira je veoma pogodan hranljivi supstart za veliki broj mikroorganizama, postoji mogućnost razmnožavanja i aktivnosti raznovrsne kvaščeve mikroflore, kako prije početka, tako i u toku vrenja. 56

Ako ovakva šira spontano previre, bez intervencije sumpor-dioksidom i selekcionisanim vinskim kvascem, može se dobiti vino lošijeg kvaliteta. U okolnostima spontane fermentacije obično se u početku intenzivno razmnožavaju divlji kvasci, uglavnom Kloeckera apiculata, kojim imaju slabu fermentativnu sposobnost. Oni stvaraju l malo alkohola i l relativno veliku količinu isparljivih kiselina, l estara i drugih sastojaka koji nepovoljno utiču na kvalitet vina. U ovakvim uslovima tek kasnije dolazi do intenzivne aktivnosti vinskih kvasaca koji su sposobni da dovrše alkoholnu fermentaciju i dadu vino dobrog kvaliteta. Otuda u samom početku treba suzbiti razvoj divljih kvasaca i svih drugih štetnih mikroorganizama i omogućiti razmnožavanje i aktivnost samo vinskim kvascima. 57

Primjena selekcionisanog kvasca Sprečavanje razvoja divljih kvasaca i drugih štetenih mikroorganizama (naročito bakterija) uspješno se postiže jačim sumporisanjem šire i kljuka odmah poslije muljanja groždja, odnosno cijedjenja šire. Sumpor-dioksid dejstvuje selektivno i suzbija razvoj nepoželjnih mikroorganizama dok se vinski kvasci otporniji perma SO 2 razmnožavaju u početku nešto sporije, ali kasnije normalno obavljaju vrenje. Osim sumpor-dioksida za suzbijanje razvoja štetne mikroflore u praksi se širi, odnosno kljuku, prije početka vrenja, dodaje i tzv. selekcionisani vinski kvasac. Obično se kombinuje jače sumporisanje šire selekcionisanim kvascem, čime se sigurnije dobija vino dobra kvaliteta. 58

Selekcionisani vinski kvasci su specijalne rase vinskog kvasca gajenje u čistoj kulturi koje se izrazito odlikuju jednom ili više pozitivnih osobina. Prema opštem kriterijumu dobar vinski kvasac treba da posjeduje ove osobine: ¬ veliku brzinu razmnožavanja, ¬ veliku energiju (intenzitet) vrenja ¬ otpornost prema niskim i visokim t-ma, ¬ otpornost prema većoj količini SO 2 ¬ stvaranje visokog procenta alkohola u vinu, ¬ stvaranje što više glicerina ¬ stvaranje što manje isparljivih kiselina, ¬ brzo taloženje po završetku vrenja, ¬ stvaranje kompaktnog taloga mrvične strukture. Ekološke i mikrobiološke laboratorije obično raspolažu kolekcijama rase selekcionisanog vinskog kvasca, kakav je sulfitni kvasac (otporan na veće kolčine sumpor-dioksida), hladni kvaasc (otporan na niske temperature) alkohologeni kvasac (stvara visok procenat alkohola). 59

Dodavanjem selekcionisanog vinskog kvasca širi omogućava mu se dominantna uloga u fermentaciji, jer se brže razmnožava i počinje intenzivno vrenje prije nego što se razmnože divlji kvasci i ostali kvasci koji su se zatekli u širi prije dodavanja selekcionisanog kvasca. U tehnologiji vina česta je upotreba selekcionisanog kvasca u alkoholnoj fermentaciji. Češće su i godine u kojima usled loših vremenskih prilika groždje jače truli. Tada se šira mora sumporisati jakim dozama sumpor-dioksida da bi se suzbio razvoj štetne mikroflore. U takvim slučajevima je neoophodno dodavati sulfitni selekcionisani vinski kvasac. I u godinama s niskim temepraturama (10 -15 Co) u periodu berbe i prerade groždja, mora se dodavati hladni selekcionisani kvasac, jer, inače, fermentacija počinje sa većim zakašnjenjem i sporo protiče. i Selekcionisani visnki kvasac korisno dodavati i kada su uslovi prerade groždja normalni! 60

Spravljanje selekcionisanog kvasca 61

Spravljanje selekcionisanog kvasca l l l Steriliše se nekoliko litara šire u staklenom balonu sa zapušačem od vate na temperaturi oko 100 Co, 20 -30 minuta. Pošto se šira ohladi na 30 o. C doda se čista kultura iz epruvete, odnosno staklene boce, i balon ponovo zapuši. Ako se koristi više rasa selekcionisanog kvasca, sve se one dodaju istoj širi, te se na taj način pomiješaju. Poslije 2 -3 dana, na sobnoj temperaturi, kvasac će se razmnožiti i početi sa intenzivnim vrenjem. Na taj način se dobija tzv. matični kvasac. Od matičnog kvasca sada treba spremiti (razmnožiti) potrebnu količinu kvasca koji će se direktno dodavati širi u sudovima za vrenje. Treba pripremi čisto i dobro sumporisano bure zapremine nekoliko hektolitara i u njega se sipa prethodno na 70 -80 Co pasterisana šira. Kada se šira ohladi na oko 30 Coo doda joj se izvjesna količina matičnog kvasca iz balona, vodeći računa da se prilikom izlivanja iz balona ne inficira ostatak u balonu. Poslije 1 -2 dana počeće burna fermentacija, pa je to radna kultura 62 selekcionisanog kvasca.

Spravljanje selekcionisanog kvasca Ovako spravljena radna kultura selekcionisanog kvasca dodaje se širi odmah poslije njenog razlivanja u sudove za vrenje. l Širi se obično dodaje oko 2 litra selekcionisanog kvasca na svakih 10 litara šire. Prije razlivanja u sudove za vrenje šira treba da bude staložena i sumporisana odgovarajućom dozom sumpor-dioksida. Selekcionisani kvasac se ne smije dodavati širi odmah poslije njenog sumporisanja, jer bi dobrim dijelom, uginuo, već treba sačekati bar 3 -4 časa, da s u međuvremenu veći dio sumpor-dioksida veže za šećer, tako da preostala količina u slobodnom obliku ne utiče štetno na kvasac koji se dodaje. i i i l 63

Pored izrazito povoljnih osobina, koje posjeduju pojedine rase selekcionisanog vinskog kvasca za fermentaciju šire ima, u odnosu na kvalitet vina ova preimućstva: ü Alkoholna fermentacija brže počinje, ranije se završava i ima normalniji tok, jer ne dolazi do raznih usporavanja i smetnji. ü Fermentacija protiče do kraja i rijetko se dešava da u vinu ostane neprevrela šećera. ü Dobija se vino s nešto više alkohola (0, 2 -0, 3%) i manje isparljivih kiselina nego u spontanoj fermentaciji šire. Nešto više alkohola u vinu dobija se i kada se koriste selekcionisane rase, koje nijesu izrazito alkohologene, jer se samim dodavanjem selekcionisanog kvasca suzbija razvoj divljih kvasaca, koji bi za svoje razviće potrošili izvjesnu količinu šećera, te i na taj način smanjili randman alkohola. ü Dobija se vino čistijeg i izrazitijeg vinskog ukusa i mirisa, a i prijatnijeg bukea tokom starenja vina. ü Vino se po završetku vrenja brže i bolje bistri, kvasac se brže 64 taloži i vino ostaje skoro potpuno bistro.

65

66