TESEICSI POSTUPAK NAA ISKUSTVA Sanja Vujisi ivkovi Daria

TESE-ICSI POSTUPAK NAŠA ISKUSTVA Sanja Vujisić Živković, Daria Hafner, Mladen Stojčić KB “Sveti Duh”, Zagreb

Čimbenici koji utječu na plodnost muškarca • • • Hormonski status Genitalne infekcije Kromosomske aberacije Promjene na genskoj razini Kemijski i fizikalni čimbenici

• Dijagnoza AZOOSPERMIA: odsustvo spermija u ejakulatu i nakon centrifugiranja • Azospermija pogađa 1 – 3 % populacije • Od ukupnog broja muškaraca koji traže evaluaciju plodnosti, u 10% slučajeva utvrdi se odsustvo spermija

• Analiza kvalitete sjemena: o Dva puta u razmaku od najmanje dva mjeseca o U slučaju azoospermiae obavezno centrifugiranje uzorka i pregledavanje talog (u 35% slučajeva nađu se spermiji dostatni za postupak ICSI) o Biokemijska analiza sjemene tekućine: fruktoza, kisela fosfataza, citratna kiselina, cink, LDH-X • Mikrobiološka analiza ejakulata i urina o Opstrukcija izvodnih kanala o Urogenitalne infekcije dovode do porasta koncentracije protuupalnih citokina u sjemenoj tekućini. Kao posljedica, javljaju se slobodni radikali. Povećana koncentracija slobodnih radikala uzrokuje smanjenje koncentracije nezasićenih i porast zasićenih masnih kiselina, što izravno utječe na promjene propusnosti membrane spermija.

Analiza hormona: - FSH (< 12 IU/L) stimulira Sertolijeve stanice koje utječu na spermatogenezu - Inhibin B (ref. 300 pg/ml; > 80 pg/ml) se stvara u Sertolijevim stanicama kao odgovor na stimulaciju FSH, koncentracija je inverzna koncentraciji FSH - LH , testosteron, hormoni štitnjače Primarni hipogonadizam hipergonadotropni hipogonadizam : - niskom razinom testosterona u serumu i visokim koncentracijama FSH i LH. - izazvan je nepravilnostima u tkivu testisa, čiji uzrok mogu biti: kongenitalni anorhidizam, kriptorhizam, zaušnjaci, genetske nepravilnosti (Klinefelter-ov sindrom, nepravilnosti androgenih receptora i enzima), sindrom samo Sertoli-evih stanica (engl. Sertoli cell only), autoimuni sindromi (anti. Leydig stanična nepravilnost) testikularna trauma, tumori, infekcije, kemoterapija, radijacija ili ovisnost o alkoholu Sekundarni hipogonadizam hipogonadotropni hipogonadizam: -niska ili niskom-normalnom razinom FSH i LH, niska razina testosterona. - izazvan je nepravilnostima u radu hipotalamusa ili hipofize što za posljedicu ima nedostatnu stimulaciju Leydig-ovih stanica. - uzroci mogu biti različiti uključujući: Kallmann-ov sindrom, Prader-Willi sindrom, tumore i lezije hipotalamusa i hipofize, hiperprolaktinemiom, radijacija, različite terapije ljekovima - sekundarnim hipogonadizmom bolja prognoza: hormonskom stimulacijom se može potaknuti tkivo testisa.

Citogenetska i genetska analiza Citogenetska analiza - učestalost kromosomskih nepravilnosti kod azospermije 17, 3% od čega 7 -13% na konstituciju 47, XXY (Klinefelter-ov sindrom) - aneuploidije spolnog kromosoma vezane su za promjene u produkciji gameta (Klinefleterov sindorm; 45, X/46, XY gonadalna disgeneza). -promjene na razini zametnih stanica: strukturne preraspodjele (translokacija, inverzija i delecija) koje se zadržavaju tijekom spermatogeneze kroz mitotičke i mejotičke diobe do stadija zrelog spermija - pacijent s normalnim brojem i strukturom somatskih kromosoma može pokazati različite nepravilnosti na svakoj stepenici mejoze zametnih stanica. Genske analize: -genetski poremećaji i do 25% azospermija -geni za faktor azospermije (AZF) (dugom kraku Y kromosoma): AZFa, AZFb, AZFc i AZFd. Delecija na proksimalnom dijelu (AZFa i AZFb) - poremećaje u spermatogenezi, ; delecije AZFc i AZFd regije mogu imati rezidualnu spermatogenezu. -kongenitalna bilateralno odsustvo vas deferensa (CBAVD) javlja se u 1 -2% slučajeva , većina CBAVD ima mutaciju za cističnu fibrozu (CFTR engl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) s povećanim rizikom varijante 5 T. -Kallmann-ov sindrom mogu uzrokovati muacije vezane za X kromosom, a posljedica je izostanak sinteze Gn. RH koja uzrokuje hipogonadotropni hipogonadizam.

• • • • Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006 Feb 1; 124(2): 197 -203. Epub 2005 Sep 12. Cytogenetic analysis of azoospermic patients: karyotype comparison of peripheral blood lymphocytes and testicular tissue. Stipoljev F, Vujisić S, Parazajder J, Hafner D, Jezek D, Sertić J. Source Clinical Cytogenetic Laboratory, Department of Obstetrics and Gynecology, Medical School, University of Zagreb, Sveti Duh Hospital, Sveti Duh 64, 10000 Zagreb, Croatia. stipoljev@yahoo. com Abstract OBJECTIVE: The objective was to compare the results of a complete chromosomal, genetic and histological investigation in 13 azoospermic men with the results of the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) procedure. STUDY DESIGN: Peripheral blood samples were used for the measurement of follicle-stimulating hormone (FSH) levels, chromosomal analysis, microdeletions in the azoospermia factor (AZF) region of the Y chromosome and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) mutation analysis. Testicular tissue was used for histological scoring and cytogenetic evaluation. RESULTS: Peripheral blood cytogenetic analysis revealed a normal male karyotype in all cases. Chromosomal analysis from testicular tissue revealed a mosaicism for the terminal deletion of chromosome 22 with a breakpoint site at 22 q 13 in one patient with congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD). Deletions in the AZFa, ATFb, and AZFc regions were not detected. The CFTR mutational analysis showed normal results in all patients. CONCLUSIONS: Cytogenetic evaluation of testicular tissue should be performed in non-obstructive and obstructive azoospermic patients as well as in patients with multiple failed IVF and recurrent spontaneous abortion.

Urološki pregled i mišljenje o Anamneza (stil života, preboljene bolesti, kronične bolesti, lijekovi, . . ) o Klinički pregled (palpatorni i UZV – ESHRE guidelinses): kriptorhizam, proširene vene u testisima, kongenitalne malformacije (izostanak vas deferensa), tumor, trauma. . o Nalaz hormona, analize kvalitete sjemena, mikrobiološke analize, citogenetske i genetske obrade o Terapijski postupci: operativna rekonstrukcija (EVS, orchidopexiam, op. varicocela), hormonska terapija • Opstruktivna azospermija: o Spermatogeneza očuvana o Blokiran transport spermija izvodnim kanalom • Ne-opstruktivna azospermija o Problem : na razini testisa, na predtestikularnoj razini o U 50% slučajeva prisutni lokusi spermatogeneze u testisima o Nema za sada testa koji sa sigurnošću može predvidjeti uspješnost postupka dobivanja pozitivnog nalaza

Retrospektivni prikaz • razdoblje od 10. 2009. – 04. 2012. o kriopohrana tkiva testisa • broj parova: 22 • broj postupaka: 40

n=13: opstruktivna azospermija (trauma, upalni proces) n=2: status post op retrogradna ejakulacija (+diabetes melitus i insufficientio ren; st post op ca recti) n=3: status post EVS (+ atrophio testis, FSH 21 IU/L; + agenesio renis dex. ; +diabetes mellitus) PACIJENTI DOB: 28 -50 (37, 3) n=1: status post hernioplasticam, atrophio testis , FSH 18 IU/L n=1: erektilna disfunkcija n=2: orhydopexiam (+heterozigot na cističnu fibrozu; + varricocole)

Pacijentice • Dob 25 – 43 (33) • Stimulacijski protokol o 22 agonisti / HP-HMG ili r. FSH o 3 klomifen / HP-HMG ili r. FSH o 6 HP-HMG ili r. FSH o 9 HP-HMG ili r. FSH/antagonisti

UROLOŠKA SALA - ZAHVAT SE ODVIJA U LOKALNOJ ANESTEZIJI - - OTVORENA OPERACIJA NA TESTISU - - (infiltracija sjemene vrpce 2% Xylocain-om) (medijalna incizija → avaskularna regija → zarezivanje tunicae albugineae → testikularni parenhim) UZIMANJE TKIVA S DVA MJESTA cca 5 mm 3 - UZORAK U STERILNU POSUDU S FIZIOLOŠKOM OTOPINOM - DOSTAVLJA SE U LABORATORIJ TELEFONOM SE JAVLJA NALAZ, UKOLIKO JE POTREBNO IDE SE NA DRUGI TESTIS

LABORATORIJ ZA HUMANU REPORDUKCIJU - identifikacija uzorka - obrada uzorka -tkivo testisa se stavlja u Petrijevu posudu sa Sperm Wash medijem (SAGE) - na grijanoj plohi lupe, tkivo se pomoću igala G 21 reže na promjer 1 mm 3 - dva do tri komadića se maceriraju - preostalio tkivo se prebacuje u četverozdenačne Nunc posudu sa Sperm. Wash medijem - na grijanoj plohi inverznog mikroskopa tkivo se analizira

POZITIVAN NALAZ BIOPSIJE TESTISA PRIPREMA ZA POSTUPAK ICSI -macerirano tkivo se ispire centrifugiranjem 2 x 300 g - talog se nasloji hranilištem za fertilizaciju (Ferilization Medium, SAGE) - nakon dva sata supernatant se još jednom centrifugira, a talog se stavlja u pripremljene kapi - talog nakon centrifugiranja se stavlja u pripremljene kapi KRIOPOHRANA TKIVA -tkivo se nakon ispiranja u mediju Serm Wash , provlači kroz medij za kriopohranu (Sperm Freezing Medium SAGE) -pripremljeni uzorci se stavljaju u krioampule i kontrolirano im se snižava temperatura -2 C/min do temperature od -30 C - pohranjuju se u spremnik za tekući dušik

-KADA JE POTVRĐENO DA U UZORKU TIKIVA TESTISA IMA SPERMIJA, PRISTUPA SE PUNKCIJI I ASPIRACIJI FOLIKULA - DVA SATA NAKON PUNKCIJE FOLIKULA OOCITE SE PRIPREMAJU ZA POSTUPAK ICSI medij s tobrađenim kivom testisa 7% PVP medij s oocitom

REZULTATI • fertilizacija jajnih stanica: 87% • 14 trudnoća o 10 u svježim postupcima TESE-ICSI o 3 nakon odmrzavanja tkiva testisa o 1 nakon krio ET (blizanačka trudnoća) • 2 spontana pobačaja • 3 biokemijske trudnoće • kumulativno: 9 poroda / 22 bračna para) (40, 9%)

Prikaz dvije pacijentice • I slučaj: 6 ET 3 trudnoće, jedna biokemijska, jedna rani spontani pobačaj, nakon obrade dokazana trombofilija , treća trudnoća donešena uz terapiju niskomolekularnim heparinom • II slučaj: 4 ET dvije trudnoće, jedna biokemijska, jedan rani spontani pobačaj

Uspješnost: literaturni podaci Esteves SC, Miyaoka R, Agarwal A. Sperm Retrieval Techniques for Assisted Reproduction. International Braz J urol 2011. 37 (5): 570 -83 • Uspješnost TESE/ICSI postupka u parova s diagnozomom opstruktivne azospermije o o o o Dobivanje spermija u 90 - 100% Uspješnost u dobivanju spermija ne ovisi o uzroku opstrukcije Nema razlike u uspješnosti postupka sa svježeg ili tkivom nakon odmrzavanja Feritilizacija ICSI postupkom 45 – 75% Uspješnost ostvarenih trudnoća 26 -57% Živorođene djece 18 -55% Uspješnost ishoda postupka determinirana s dobi žene

• Uspješnost TESE/ICSI postupka u parova s diagnozom ne-opstruktivne azospermije o Dobivanje spermija 49, 5% o Ukoliko je prethodni histopatološki nalaz ukazivao na hipospermatogenezu, izolirani su spermiji u 85% slučajeva o Ukoliko je histopatološki nalaz bio neadekvatan, spermiji su izolirani u 6 -25% slučajeva o Pokazalo se da FSH nije prediktivni čimbenik o Kod djelomične ili ukupne delecije AZFc u 70% slučajeva izolirani spermiji, za razliku od oštećenja regije AZFa ili AZFb o U slučaju sindroma Klinefelter u 50% slučajeva izolirani spermiji, dok je uspješnost ostvarenih trudnoća 30% do 50%, a rođena djeca imaju uredan kariotip. Rezultati su bili bolji u slučaju kada su pacijenti prošli terapiju medikamentima o Kod varicocele, pokazano je ukoliko je ona tretirana, u 53% slučajeva je nalaz bio pozitivan za razliku od 30% u pacijenata s netretiranom varcocelom o Uspješnost postupka (fertilizacija, ostvarene trudnoće) je bila bolja u svježem postupku

Da li je povećan rizik malformacija u djece začete TESE/ICSI postupkom • Feddor i sur. (ESHRE 2007) o Analiza rođene djece u Danskoj i Norveškoj (ukupno 412) o Nije prisutna veća učestalost malformacija u djece rođene nakon TESE/ICSI postupku u poredbi s djecom začetom u postupku IVF ili nakon spontanog zanošenja. o Uočen je porast hipospadije.

Woldringh GH, Besselink DE, Tillema AHJ , Hendriks JCM , Kremer JAM. Karyotyping, congenital anomalies and follow-up of children after intracytoplasmic sperm injection with non-ejaculated sperm: a systematic review. Hum Reprod Update 2010; 16 (1): 12 -19 • • • Literaturni pregled s ciljem istražiti da li postoji potreba zabrinutosti glede ICSI postupka sa spermijima dobivenim kirurškim putem U obzir je uzet kariotip ploda, malformacije, praćenje djece Rezultati su pokazali da je u literaturi prisutno 8 relevantnih studija, dvije navode kariotip, 5 malformacije, 1 navodi praćenje djece Veće malformacije: o 543 od 12 377 (4. 4%) u postupku ICSI sa spermijima iz ejakulata o 17 od 533 (3. 2%) u PESE/ICSI postupku o 31 od 670 (4. 6%) TESE/ICSI Nepravilni kariotip: o 55 od 1973 (2. 8%) u postupcima ICSI sa spermijima iz ejakulata o 0 od 31 u slučaju PESE/ ICSI o 5 od 191 (2. 6%) u postupku TESE/ ICSI ZAKLJUČAK: Iako nema statistički značajne razlike, autori smatraju da su navedene grupe male i heterogene, te preporučuju standardiziranu metodologiju u „follow-up” studijama nakon MPO. CONCLUSIONS: Although there were no statistical differences, the study groups were small and heterogenic, with a number of potential biases. We therefore recommend a standardized methodology of follow-up studies after ART, with well-defined groups of ICSI with ejaculated sperm, ICSI with epididymal sperm and ICSI with testicular sperm, and a control group of naturally conceived children.

Belva F, De Schrijver F, Tournaye H, Liebaers I, Devroey P, Haentjens P, Bonduelle M. Neonatal outcome of 724 children born after ICSI using non-ejaculated sperm. Hum Reprod. 2011 Jul; 26(7): 1752 -8. Center for Medical Genetics, UZ Brussel, Belgium • 530 djece rođene u postupku TESE/ICSI i 194 djece rođene u postupku PESE/ICSI • 2516 djece rođene u postupku ICSI sa spermijima iz ejakulata • ZAKLJUČAK: dobiveni rezultati ohrabruju, djeca rođena u postupcima sa spermijima dobivenim kirurškim putem po praćenim parametrima se ne razlikuju od djece rođene u postupku ICSI sa spermijima iz ejakulata. • Conclusion: Overall neonatal health in terms of birth parameters, major anomalies and chromosomal aberrations in our large cohort of children born by the use of non-ejaculated sperm seems reassuring in comparison to the outcome of children born after the use of ejaculated sperm.

HVALA