Techniques immunologiques utilisant des ractifs marqus quipe pdagogique

Techniques immunologiques utilisant des réactifs marqués Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) GRELIER – DURAND - POCHET 1

Principe et définitions Techniques utilisant une mise en évidence des immuns complexes par un conjugué Conjugué = Ag - marqueur ou Ac - marqueur Marqueur = molécule détectable • Isotope radioactif : émission de rayonnements • Enzyme : catalyse la formation d’un produit coloré • Fluorochrome : émission de fluorescence 2

Conjugués Conjugué = Antigène ou Anticorps marqué ◦ Liaison du marqueur à l’Ag ou Ac ◦ laissant libre épitope ou paratope ◦ tout en diminuant leur affinité par rapport aux composés non marqués 3

Techniques en phase hétérogène ou homogène Phase hétérogène : o Formation des complexes immuns sur un support o Nécessite des étapes de lavage o Les plus utilisées Phase homogène : o Complexes immuns formés en phase liquide o Pas d’étape de lavage o Activité du marqueur différente quand le conjugué est libre ou lié 4

Techniques directes et indirectes Techniques directes : o Marquage réalisé en 1 seule étape (hors lavages et révélation) o 1 seul réactif utilisé Techniques indirectes : o Marquage nécessitant plusieurs étapes o Plusieurs réactifs utilisés o Plusieurs complexes immuns formés 5

Techniques compétitives et non compétitives Techniques compétitives : o Compétition entre § un élément recherché § son homologue marqué o Ajout simultané des réactifs Techniques non compétitives : o Ajout successif des réactifs o Lavages entre 2 réactifs ajoutés 6

Radioimmunologie (RIA) Marqueur = Isotope radioactif élément chimique possédant les mêmes propriétés chimiques, le même Z que l’élément mais des masses atomiques différentes par nombre différent de neutrons caractérisé par une période ou demi-vie, un noyau énergiquement instable libérant de l’énergie sous forme de rayonnement : désintégration radioactive mesurée Risque physique : utilisation limitée 7

Immunoenzymologie Marqueur = Enzyme ◦ Définition : catalyseur biologique se fixant spécifiquement sur un substrat catalysant la formation d’un produit ◦ Exemples : Phosphatase alcaline (PAL) PNPP incolore PNP jaune Peroxydase (HRP) catalysant l’oxydation de divers substrats par l’intermédiaire de H 2 O 2 8

ELISA non compétitive indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Salmonella dans un aliment Plaque 96 puits Produit (PNP) Substrat (PNPP) Ac anti-Salmonella. PAL Echantillon SAB Ac anti. Salmonella Lavage 9

ELISA compétitive directe en phase hétérogène Ex : dosage d’une toxine bactérienne Produit Substrat Toxine (échantillon) Lavage Toxine marquée = Conjugué SAB : saturation Anticorps anti-toxine 10

Immunofluorescence Marqueur = Fluorochrome molécule capable : ◦ d’absorber une lumière de faible longueur d’onde de passer un état excité ◦ de revenir à son état fondamental en émettant un rayonnement lumineux de longueur d’onde plus élevée S 1 ’ S 1 ex h bée r o bs a e rgi e n É em h e mis é gie r e Én So temps 11

Marqueurs Principaux fluorochromes utilisés FITC Fluoresceine Iso. Thio. Cyanate TRITC Tetraméthyl Rhodamine Iso. Thio. Cyanate Absorption Émission 495 nm 525 nm 545 nm 575 nm 12

Microscope à épifluorescence n n Émission d’un rayonnement intense (UV et visible) par une lampe à vapeur de mercure ou faisceau LASER Focalisation par une lentille Sélection du spectre par un filtre d’excitation (490 nm) Diffraction du faisceau par le miroir dichroïque n n via l’objectif vers l’objet Excitation du fluorochrome Émission d’un rayonnement de plus faible énergie passant par n n l’objectif le miroir dichroïque un filtre sélectionnant les longueurs d’onde (> 500 nm) l’oculaire 13

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Ac anti -Taylorella Lame IFI Fixation du prélèvement 14

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Lavages 15

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Conjugué : Ac anti Ig - FITC 16

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Lavages 17

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Résultats + 18

Immunofluorescence : autres techniques Immunofluorescence en phase hétérogène directe Immunofluorescence en phase homogène (cytomètre de flux) Immunofluorescence indirecte sandwich 19