La colorazione dei preparati istologici Colorazione di un

La colorazione dei preparati istologici

Colorazione di un campione • Ha lo scopo di aumentare il contrasto dei componenti morfologici cellulari o tessutali affinché ne risulti una migliore analisi microscopica (istomorfologia), oppure quello di identificare e localizzare specifiche sostanze chimiche all’interno di una cellula (citochimica) o di un tessuto (istochimica) • Si sfrutta la proprietà di alcuni reagenti di formare con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti dei prodotti colorati (nel caso di microscopia ottica) o dei prodotti opachi agli elettroni (nel caso di microscopia elettronica).

Tipi di colorazioni • Colorazioni istomorfologiche • Colorazioni istochimiche • Colorazioni immunoistochimiche PS: in realtà talvolta la distinzione tra i primi due tipi non è netta

Tipi di Colorazione Istomorfologiche • Colorazioni fisiche (SUDAN, Oil Red, chiamati anche lisocromi): Sostanze colorate possono sciogliersi selettivamente in strutture del preparato, senza che si instaurino legami chimici tra le molecole colorate e quelle del preparato stesso. • Colorazioni chimiche: a) Composti colorati possono formarsi per reazioni chimiche tra molecole del tessuto e reagenti NON colorati; b) Coloranti in soluzione possono fissarsi a strutture microscopiche mediante legami forti (legami covalenti, legami ionici) o legami deboli (ponti idrogeno, forze di Van der Waals).

Tipi di coloranti • Coloranti Naturali – Animale (Carminio) – Vegetale (Ematossilina, Orceina) • Coloranti Artificiali – Coloranti di anilina (Coal-tar dyes) , composti organici con gruppi cromofori dai quali dipende il colore • Gruppo cromogeno: sostanza colorata ma priva di proprietà coloranti • Gruppo auxocromo: gruppo che lega chimicamente le proteine o altre componenti PS: il colore è dato dall’assorbimento selettivo di particolari lunghezze d’onda

Tipi di coloranti • Si definiscono coloranti Acidi o Basici, non in base alla presenza di idrogenoni in una loro soluzione, ma grazie alle proprietà del loro auxocromo • Per es un colorante messo in acqua: – se ha un gruppo -NH 2, è basico – Se ha un gruppo -COOH, è acido – Si preferisce definirli Anionici e Cationici

Meccanismo d’azione dei coloranti • La colorazione dipende da tre principali fattori – Affinità dei componenti tissutali – Concentrazione dei costituenti nel tessuto – Permeabilità • Colorazione progressiva – Si lascia agire il colorante fino all’ottenimento del giusto grado di colorazione • Colorazione regressiva – Il campione viene sovraccolorato e differenziato eliminando l’eccesso di colorante

Esempi di coloranti • • Ematossilina: nuclei Eosina: citoplasma Fast Green: collagene Fucsina acida: citoplasma Fucsina basica: nuclei Metil Verde: nuclei Orange G: cheratina

La colorazione • Il campione deve essere portato nell’ambiente in cui agisce il colorante • Reazione di colorazione • Il campione deve essere portato in un ambiente che mantenga la colorazione • Montaggio

Esempio: Ematossilina-Eosina • Componenti: – Ematossilina: componente basico, lega il DNA – Eosina: componente acido, lega le componenti citoplasmatiche • Procedura: – Colorazione in Ematossilina – Passaggio in acqua – Colorazione in Eosina – Passaggio nella serie degli alcooli – Chiarificazione in xylene-bioclear – Montaggio in resina

Intestino tenue

Ci sono vari tipi di ematossilina • L’ematossilina è una sostanza che si estrae dal legno di campeggio. • E’ di colore giallognolo ed in realtà non è un colorante, lo diviene solo in forma ossidata (emateina) • L’emateina colora (lacca) in presenza di un mordenzante, solitamente un allume • Possiamo avere lacche alluminiche ferriche e cromiche

Quando usare una ematossilina piuttosto che un’altra? • Dipende dal tipo di campione • Dipende dalla colorazione finale • Ogni colorazione solitamente indica l’ematossilina da utilizzare (es tricromiche)

Mordenzanti o Mordenti • Alcuni metodi di colorazione comportano la cosiddetta mordenzatura • Questa operazione consiste nel trattare il tessuto con un composto capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali a loro volta potranno legarsi con un colorante basico o Acido • La maggior parte dei mordenti impiegati in istologia sono ossidanti – acido cromico, acido fosfomolibdico, acido fosfowolframico, acido nitrico – cloruri di Pb, Zn, Hg – permanganato di potassio - Acido picrico - iodio

Alcian Blue • Colora mucosostanze acide (mucine, vedi ghiandole mucipare caliciformi, riconoscimento istopatologico di alcuni mesoteliomi)

controcolorazione Colorazione regressiva

Colorazioni Tricromiche • Sfruttano l’uso di coloranti differenti (coloranti acidi o basici) oppure possono sfruttare la differente affinità dei componenti tissutali

Tricromica di Mallory In questa colorazione il colorante nucleare, l’emallume di Mayer, colora le strutture acide in violetto intenso, mentre i coloranti acidi sono blu di anilina e orange G. Questa colorazione viene usata quando i pezzi sono fissati in formalina

Tricromica di Masson E’ particolarmente indicata per riconoscere i vari tipi di cellule del connettivo. Colora i nuclei in viola con l’ematossilina; il citoplasma in rosso più o meno vivo con la fucsina acida, il connettivo e le strutture fortemente basiche in blu con il blu di anilina.

Blu di toluidina • Colorante Metacromatico • La metacromasia consiste nel cambiamento di colore quando esso si lega a determinati gruppi chimici.

• I coloranti metacromatici sono basici di colore blu (Blu di Toluidina, Azzurro A, Blu di Cresile) si possono legare ad alcuni composti chimici ad alto peso molecolare e contenenti gruppi anionici (es: glicosaminoglicani nella cartilagine), e quindi assumere una colorazione diversa dalla loro. • In soluzione si trovano allo stato monomerico, , se si legano in gran quantità a un substrato, formano dimeri e polimeri, appaiono di colore rosso (metacromatico)

Protocollo colorazione blue di toluidina • Colorare 2 minuti in una soluzione allo 0. 1% di blu di toluidina in alcool a 30° • Sciacquare in etanolo a 95° • Disidratare in etanolo assoluto: 2 volte per 2 minuti • Trattare in xilene/Bioclear: 2 minuti • Montare in resina sintetica

Mast cellule dell’intestino

cartilagine

Sezione trasversale di intestino tenue, colorata con blu di toluidina

GIUNZIONE MIO-TENDINEA tendine Fibra muscolare Fibre collagene endomisio fibroblasti