Anatomia Patologica Studia le alterazioni di cellule e

Anatomia Patologica Studia le alterazioni di cellule e tessuti provocate dalle malattie Scopo di identificare cause e conseguenze

Testi consigliati: - Anatomia Patologica e correlazioni anatomo-cliniche. G. M. Mariuzzi. Piccin 2006 -Le basi patologiche delle malattie. Robbins e Contran. Elsevier 2005 -ANATOMIA PATOLOGICA. LE BASI. Ruco, Scarpa. UTET, 2007.

Il processo che porta allo sviluppo di una malattia comprende due fasi Eziologia (azione dell’agente eziologico) Patogenesi (processo che si innesca) Infiammatoria Degenerativa Neoplastica

Compito dell’anatomopatologo Analizzare cellule e tessuti prelevati da pazienti Formulare una diagnosi ovvero identificare il processo patologico Valutare il danno Esprimere una valutazione prognostica ovvero le probabilità evolutive Indirizzare le scelte terapeutiche Offrire le tecnologie a sua disposizione per il follow-up (immunoistochimica, biologia molecolare, etc. )

IL LABORATORIO DI Anatomia patologica D r

q Preparare in maniera adeguata campioni di tessuti, organi o liquidi biologici, ai fini diagnostici q. Attraverso un insieme di operazioni fisiche e chimiche atte ad informarci sulle caratteristiche dei tessuti e/o cellule

q Responsabilità medico-legali perché: ü il campione in esame talvolta è unico ü non sempre è possibile ottenere, per motivazioni tecniche o cliniche, un nuovo campione biologico ü Campioni: bioptici, chirurgici, citologici Dimensione del campione Infermiere aiuta il medico nella preparazione e nell’ esecuzione dei prelievi

Metodi di preparazione del campione per microscopia ottica

Tempi principali Prelievo (spetta al Medico affiancato dal tecnico) q Fissazione q Lavaggio q Inclusione (paraffina) q Taglio q Sparaffinatura q Colorazione q Montaggio Osservazione al M. O. Diagnosi

q Fissazione Ø blocca i processi autolitici e putrefattifivi tissutali Ø consente al campione di sopportare gli stress fisici e chimici delle fasi successive di lavorazione Ø mantiene un buon grado di reattività e riproducibilità dei preparati ottenuti al taglio

q Fissazione Infermiere ! Ø deve essere rapida Ø tempi variano a seconda del fissativo utilizzato e delle dimensioni del campione Ømantenere un esatto rapporto volumetrico tra fissativo e tessuto (circa 1: 20) Øp. H ottimale (p. H 7. 3 -7. 4) e una pressione osmotica intorno a 0. 5 oms (una pressione osmotica più bassa (0. 3 oms ) produce rigonfiamento cellulare)

q Fissazione Fissativi Ø chimici – semplici – miscele fissatrici Ø fisici - calore - congelamento

fissativi chimici semplici principali Additivi e non additivi Coagulanti e non coagulanti • Formaldeide (n. c. a. ) • • glutaraldeide alcool etilico alcool metilico tetrossido di osmio bicromato di potassio cloruro di mercurio acido acetico glaciale acido picrico

Miscele fissatrici principali Composte da due o più agenti fissativi • • Migliorano il risultato del fissaggio liquido di Bouin liquido di Carnoy liquido di Gendre liquido B 5 liquido di Zenker liquido di Heidenhain liquido di Muller

Il fissativo comunemente impiegato in istologia è la formaldeide usata in soluzione acquosa al 40% che assume il nome di formalina. La soluzione più utilizzata di formalina è quella neutra tamponata al 10% con p. H tra 7. 2 – 7. 4 40% 500 ml, Na 2 HPO 4 32. 5 g, Na. H 2 PO 4 20 g) (ACQUA DISTILLATA 4. 5 L, FORMALDEIDE

Formalina Principali caratteristiche Ø qualità di fissazione ottima Ø elevata capacità di penetrare nei tessuti Ø elevata stabilità nel tempo, utile per la conservazione dei campioni per lunghi periodi Ø non coagula le proteine, non dissolve i lipidi, rispetta i glucidi Ø basso costo Ø Irritante, cancerogena, teratogena

Alcool etilico svantaggi dell’alcool etilico a 90°-95° • denaturazione delle proteine • agisce da solvente dei grassi

Miscele fissatrici

Liquido di Bouin q Fissativo, di colorito giallo, costituito da - acido picrico sol. acquosa satura, 75 ml - formalina al 40%, 25 ml - acido acetico glaciale 5 ml q Ottimale per la fissazione di pezzi anatomici voluminosi e per lo studio della patologia endocrina e neuroendocrina q Solo in parte compatibile con indagini IIC q Durata di fissazione non superiore alle 3 -4 ore

Fissazione fisica: il congelamento Quando vene richiesta? Prestare attenzione al maneggiamento di tessuti freschi !!! Rischio infettivo

La fissazione a freddo si può ottenere: • per abbassamento della temperatura (esame estemporaneo) • con l’ausilio di CO 2 • con l’ausilio di gas liquidi • con l’impiego di miscele di raffreddamento

La fissazione al criostato è impiegata per gli esami su campioni intraoperatori, ponendo i frammenti su un porta-pezzo in metallo immersi in un mezzo di montaggio, ad una temperatura che varia in genere tra i -15°C e i -30°C Tempo di realizzazione: 10 -15 minuti complessivi Ø Occorre particolare abilità del tecnico Ø Da fare eseguire a personale addestrato Ø Alta responsabilità !!!!!

Criostato

q La sistemazione di un frammento nelle biocassette va posto ponendo convenzionalmente la superficie che sarà tagliata rivolta verso l’alto Standardizzazione dell’inclusione !!!

Processazione fase di lavorazione del materiale istologico che ha la funzione di • disidratare • Chiarificare (xilolo) • infiltrare di paraffina i tessuti contenuti nelle apposite bio-cassette PROCEDURA AUTOMATIZZATA E PROGRAMMABILE

q La maggior parte dei processatori lavora sotto vuoto per accelerare la penetrazione dei reattivi nei campioni q Un ciclo prevede - disidratazione (alcoli) - chiarificazione (xilolo) - impregnazione (paraffina)

Vantaggi della processazione automatica • Possibilità di avviare diversi cicli di processazione • Possibilità di far lavorare la macchina sia di giorno che di notte • Possibilità di abbreviare i tempi di processazione • Possibilità di processare grandi quantità

Inclusione in paraffina ha lo scopo di creare dei blocchetti solidi pronti per il taglio

I campioni estratti dalle cellette vengono posti in un cestello metallico dove un dispensatore farà colare la paraffina liquida fino al riempimento dello stesso cestello

q Il cestello con il suo contenuto viene quindi posto sul piano di una piastra fredda, avendo l’accortezza di spingere uniformemente sul fondo il campione q. All’abbassarsi della temperatura la paraffina solidificherà con all’interno il campione q. Si otterrà infine il blocchetto di paraffina pronto per la fase di taglio.

Taglio Scopo del taglio è creare delle sezioni di tessuto da apporre sul vetrino portaoggetto per la visione al microscopio Utilizza come strumento il microtomo A slitta Rotativi

Per raccogliere sezioni soddisfacenti è necessario che ü le sezioni abbiano uno spessore compreso tra i 3 -5 microns ü il blocchetto sia stato raffreddato prima del taglio ü l’inclinazione della lama rispetto al pezzo sia tale da ottenere una sezione parallela alla superficie del campione

q Le sezioni vengono raccolte con un pennello fine, singolarmente o in nastro, e distese in un bagno di acqua distillata a circa 40° C q Il tecnico sceglie le sezioni migliori che con l’ausilio del pennello stende su vetrini porta-oggetto sgrassati.

Prima di procedere alla colorazione occorre q sparaffinare per eliminare l’eccesso di paraffina q idratare con scala decrescente di alcoli

SPARAFFINAZIONE E IDRATAZIONE • • Xilolo ( o sostituto ) Alcool assoluto Alcool 95° Alcool 70° Acqua di fonte Acqua distillata 5’ 5’ 3’ 3’ 3’

Colorazione Scopo è creare immagini di tessuto contrastate per la visione al microscopio ottico

Ø Coloranti acidi: a carica negativa, formano sali con le basi con cui vengono a contatto. Colorano le strutture citoplasmatiche Ø Coloranti basici: a carica positiva colorano generalmente i nuclei Ø Coloranti neutri: sono formati dall’unione di un colorante basico con uno acido

Coloranti nucleari • • • Ematossilina di Carazzi Ematossilina di Mayer Ematossilina di Harris Ematossilina ferrica di Weigert Ematossilina di Ehrlich Ematossilina di Heidenhain Rosso neutro Safranina Acido carminico

Coloranti Citoplasmatici eosina Ø più utilizzato Ø colorante acido di cui ne esistono numerose soluzioni sia alcooliche acquose, queste ultime maggiormente usate La colorazione di routine in istologia è la Ematossilina – Eosina ( E&E )

Altre Colorazioni • • • PAS Van Gieson Gomori Tricromica di Mallory Tricromica di Masson Verhoeff Weigert Alcian blu Alcian – PAS Perls Rosso Congo Giemsa

PAS Ø L’impiego del PAS ha un valore fondamentale per l’evidenziazione dei carboidrati Ø Le sostanze reattive appaiono colorate in varie tonalità di rosso magenta Ø E’ spesso richiesto per le biopsie del gastroenterico.

Van Gieson Ø E’ una colorazione per il connettivo - fibre collagene in rosso - fibre muscolari in giallo - fibre reticolari non sono colorate.

Gomori Ø Metodo di impregnazione argentica per evidenziare le esili fibre reticolari che legano i sali di argento e che si colorano in nero Ø Spesso richiesta per le biopsie epatiche e del connettivo

Mallory Ø Colorazione tricromica che permette di evidenziare, oltre i nuclei e le fibre collagene, anche il tessuto muscolare -nuclei in rosso -fibre collagene in blu -tessuto muscolare liscio in violetto -tessuto muscolare striato in arancio.

Masson Ø Colorazione tricromica per le fibre collagene, le fibre muscolari e i nuclei - nuclei in blu scuro - fibre muscolari in rosso - fibre collagene in verde.

Verhoeff Ø Altro metodo per evidenziare le fibre elastiche sono colorate elettivamente in nero Ø E’ impiegata per lo studio del connettivo

Weigert Ø Colorazione che permette di evidenziare la fibrina Ø Su uno sfondo grigio chiaro la fibrina si colora in violetto.

Alcian blu Ø Metodo utilizzato per evidenziare le mucine Ø mucine debolmente acide, acido jaluronico e sialomucine in blu scuro

Alcian - PAS La combinazione di queste due colorazioni permette di ottenere informazioni preziose per l’identificazione delle mucosostanze. Ø mucosostanze alciofile in blu Ø mucosostanze sensibili al periodato del PAS in rosso E’ richiesta talora per le biopsie intestinali

Perls Colorazione per l’evidenziazione del ferro che si colora in blu E’ talora richiesta per le biopsie epatiche

Giemsa q Colorazione impiegata per evidenziare batteri Gram+ q Utilizzata per la ricerca dell’ Helicobacter Pylori nelle biopsie gastriche (in blue)

Rosso Congo Colorazione utilizzata per evidenziare l’amiloide che si colora in rosso

Analisi molecolari Immunoistochimica (utilizza anticorpi per rivelare l’espressione di molecole specifiche) Citometria a flusso (per determinare in maniera rapida il fenotipo molecolare di una popolazione cellulare ) Ibridazione in situ (utilizza sonde di acidi nucleici per individuare anomalie cromosomiche, geniche o di espressione) Citogenetica (per lo studio del cariotipo es. in aborti ripetuti o in feti malformati)

IL PRELIEVO q CITOLOGIA ESFOLIATIVA q CITOLOGIA ABRASIVA q. CITOLOGIA PER APPOSIZIONE q. CITOLOGIA PER AGOASPIRAZIONE

CAMPIONI BIOLOGICI q. A fresco q. Strisciati (strisci citologici)

Campioni strisciati q. Pap test (strisci cervico-vaginali) q. Materiale da agoaspirazione Occorre osservare che campioni mal strisciati possono compromettere il giudizio diagnostico Problematiche dei giudizi falsi negativi

Campioni “a fresco “ q Urine q Versamenti cavitari - liquido pleurico - liquido ascitico - liquido pericardico - liquido da artrocentesi - liquido da cavità cistica q Liquidi di lavaggio bronchiale q Espettorato

Campioni “a fresco” Possono essere trattati per qcitoinclusione qper striscio

Fissazione q. Utilizzare un fissativo spray (costituito da miscele a base alcolica) q. Porre il vetrino in verticale ad una distanza di 15 - 20 cm dallo spray e spruzzare un paio di puff q. Lasciare asciugare il preparato per qualche minuto

Colorazione q. Colorazione policromatica di Papanicolau (utilizza ematossilina come colorante nucleare e più coloranti per il citoplasma) q. May Grunwald Giemsa q. PAS

Striscio cervico-vaginale Citoincluso lav. bronchiale. Pos

Citol. per apposizione linfonodale. Melanoma Citol. urinaria. Pos. Versamento pleurico