Fluorescncia 1 Energia radiante Radiao eletromagntica Natureza da

Fluorescência • 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética – Natureza da radiação eletromagnética – Espectro eletromagnético. – Natureza dual: onda/partícula • 2. Fluorescência. – – Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 1/56

Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Velocidade da onda Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 2/56

Espectro da radiação eletromagnética n l Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 3/56

Espectro da radiação eletromagnética Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 4/56

Natureza dualística - onda Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 5/56

Natureza dualística - partícula Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 6/56

Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 7/56

Interação radiação EM-matéria: reflexão Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 8/56

Interação radiação EM-matéria: refração Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 9/56

Interação radiação EM-matéria: difração Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 10/56

Microscopia Confocal: Teoria e técnica • 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética – Natureza da radiação eletromagnética – Espectro eletromagnético. – Natureza dual: onda/partícula • 2. Fluorescência. – – • • Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 11/56

Luminescência – Fluorescência e fosforescência Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 12/56

Luminescência – Fluorescência e fosforescência Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 13/56

Fluoróforos de interesse em Biologia Fluoresceína Quinina Rodamina Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 14/56

Laser x HBO Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente, em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 15/56

Laser x HBO Espectro do He-Ne laser Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente, em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 16/56

Microscopia Confocal: Teoria e técnica • 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética – Natureza da radiação eletromagnética – Espectro eletromagnético. – Natureza dual: onda/partícula • 2. Fluorescência. – – • • Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 17/56

BCECF – p. H indicator

BCECF images Fluorescence images Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 19/56

Questões 1 Examine um eletródio de vidro para p. H. Identifique o eletródio sensível e o de referência. Discuta este eletródio de referência (não-polarizabilidade). Depois meça as diferenças de potencial elétrico que o eletródio desenvolve em duas soluções, de p. H 4. 05 e 6. 86. Construa a curva de calibração par o sistema. Meça a voltagem em uma solução de p. H a determinar. Determine a concentração de H+ nesta solução. 2. Considere duas soluções de KCl, de 100 m. M e 10 m. M. Suponha estas soluções em compartimentos separados por uma membrana seletiva, permeável apenas ao cátion. Qual será a diferença de potencial elétrico entre os dois compartimentos (Temperatura de 25⁰C). Aventure-se em considerações da interferência da capacitância de membrana sobre o desenvolvimento da diferença de potencial elétrico. 3. Suponha uma molécula que absorvesse fótons de uma dada energia (ħν) e emitisse radiação, relaxando ao estado basal, após alguns picosegundos (10 -12 s). Esta molécula poderia ser utilizada como fluorescente? 4. Discuta a estimativas de razão de fluorescência. Porque os indicadores que permitem medidas de razão são mais convenientes nas medidas intracelulares. Microscopia confocal, 2008 A. C. Cassola 20/56