Piante transgeniche di pomodoro tolleranti la salinit del

Piante transgeniche di pomodoro, tolleranti la salinità del suolo, che accumulano sale nelle foglie ma non nei frutti “Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit” Hong-Xia Zhang and Eduardo Blumwald Nature Biotechnology, VOLUME 19 - August 2001 (All images are used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology)

Secondo i dati del Ministero dell’Agricoltura USA: - Ogni anno, 10 milioni di ettari di campi coltivabili, un’area pari a 1/5 della California, vanno perduti a livello globale, a causa dell’eccesso di sali lasciati nel suolo dalle acque di irrigazione, che durante il loro percorso raccolgono sali solubili come sodio, magnesio e potassio e li depositano nel terreno.

• Lo stress ambientale, dovuto alle alte concentrazioni di sale nei suoli, è ed è stato uno dei più importanti fattori limitanti la produttività agricola, visto che le piante sono particolarmente sensibili alla salinità. • Attualmente, oltre ¼ delle aree agricole irrigate del mondo vedono ridurre le loro capacità produttive a causa della salinità del terreno. • Molte ricerche sono indirizzate verso il miglioramento di cultivar che incrementino l’alotolleranza.

• Gli effetti nocivi del sale sulle piante sono una conseguenza di : - effetti tossici dell’eccesso di ioni sodio nei processi biochimici; - deficit idrico derivato da stress osmotico. Per tollerare alti livelli di Na. Cl, le piante dovrebbero essere in grado di usare gli ioni per l’adattamento osmotico e per distribuire internamente questi ioni in modo da tener lontano il sodio dal citosol.

• La presenza, nelle cellule delle piante, di larghi vacuoli internamente acidi e limitati da membrane, permette un’efficiente compartimentazione del sodio nel vacuolo, attraverso il funzionamento dell’antiporto vacuolare Na+/H+. • Utilizzando la forza proton-motrice, generata dagli enzimi vacuolari H+-translocanti, l’antiporto Na+/H+ permette il trasporto, contemporaneo, di Na+ (contro il suo potenziale elettrochimico) all’interno del vacuolo e di H+ (abbattimento del suo potenziale elettrochimico) all’esterno del vacuolo, attraverso il tonoplasto. • Il gradiente salino vacuolare può , inoltre, “guidare” l’acqua nelle cellule, rendendo le piante non solo tolleranti la salinità, ma anche più efficienti nell’utilizzo dell’acqua.

• Recentemente è stato identificato e caratterizzato il gene At. NHX 1, che codifica l’antiporto vacuolare Na+/H+ in Arabidopsis thaliana. • Piante di A. thaliana sono state ingegnerizzate in modo da esprimere maggiori livelli di proteina At. NHX 1 rispetto alle piante del tipo selvatico. • Il frazionamento della cellula ha mostrato che la proteina antiporto è espressa principalmente nel tonoplasto. • Le piante transgeniche si sono dimostrate significativamente più alotolleranti grazie alla sovraespressione di un solo gene.

• La sovraespressione dell’antiporto Na+/H+ di A. thaliana, permette alle piante transgeniche di crescere in 200 m. M di Na. Cl, facendo pensare alla possibilità di ingegnerizzare piante coltivate tolleranti la salinità del suolo. • In questo studio si dimostra che piante transgeniche di pomodoro, che sovraesprimono l’antiporto vacuolare Na+/H+, sono in grado di crescere, fiorire e produrre frutti in presenza di 200 m. M di Na. Cl e che si ha alta concentrazione di sodio nelle foglie ma non nei frutti; ciò mette in evidenza il potenziale uso di piante transgeniche per coltivazioni agricole in suoli salini.

• Ipotesi di partenza: Le piante di pomodoro geneticamente modificate per avere una maggiore capacità di “sequestrare” sodio nei vacuoli, potrebbero: -evitare gli effetti tossici degli ioni Na + nel citosol; -mantenere l’equilibrio osmotico, usando gli ioni Na+ per richiamare acqua nelle cellule.

• Un costrutto, contenente il gene At. NHX 1 di A. thaliana, che codifica l’antiporto vacuolare Na+/H +, è stato introdotto nel genoma di Lycopersicon esculentum (cv Moneymaker); • Sono state ottenute 47 piante transgeniche e 6 linee omozigote, 2 delle quali sono state scelte per gli esperimenti perché crescevano molto vigorosamente in presenza di alte concentrazioni di Na. Cl.

• Piante del tipo selvatico e transgeniche hanno mostrato una crescita simile in presenza di 5 m. M di Na. Cl, ciò significa che la sovraespressione dell’antiporto vacuolare Na+/H+ non ha influenzato la crescita delle piante geneticamente modificate: (A) Piante WT; (B) Piante TP; ( Used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology )

• Mediante tecnica Western Blots, si è messa in evidenza la presenza della proteina At. NHX 1 solo nelle frazioni del tonoplasto delle piante transgeniche(TP): Western Blots : proteine di membrana fogliari testate con anticorpi specifici per la proteina At. NHX 1; Linee 1, 2, 3 corrispondono alle membrane delle piante WT; Linee 4, 5, 6 corrispondono alle membrane delle piante TP; Linee 1 – 4 : frazioni di tonoplasto; Linee 2 – 5 : frazioni del reticolo endoplasmatico e del Golgi; Linee 3 – 6 : frazioni della membrana plasmatica. ( Used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology )

• Per verificare che un’aumentata espressione dell’antiporto Na+/H+ corrisponde ad una maggiore alotolleranza : • Piante di pomodoro del tipo selvatico (WT) e transgeniche (TP) sono state fatte crescere in presenza di 200 m. M di Na. Cl, concentrazione che inibisce la crescita di quasi tutte le piante coltivate.

• Lo sviluppo delle piante WT è fortemente inibito dalla presenza di Na. Cl ad alte concentrazioni: • Le piante TP sono cresciute, fiorite ed hanno prodotto frutti: ( Used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology )

• Vescicole di tonoplasto, isolate dalle foglie, sono state aggiunte ad una soluzione tampone contenente varie sostanze tra cui acridine-orange • L’attività di scambio cationi/H+ è stata misurata osservando la diminuzione della fluorescenza, p. H-dipendente, dell’acridineorange • Attraverso le vescicole del tonoplasto è stato ottenuto un gradiente di p. H, internamente acido, mediante l’attivazione dell’enzima vacuolare H + -PPiasi ad opera di ioni Mg + +

• Una volta divenuto costante il gradiente di p. H, l’attività di trasporto H+, PPiasi- dipendente, è stata bloccata dall’aggiunta di AMDP • Sono stati, quindi, determinati, nelle vescicole isolate dalle piante WT e dalle piante TP, che sovraesprimono At. NHX 1 (X 10 E), i tassi di scambio cationi/H+ • Il monitoraggio dei movimenti degli ioni Na+, H+dipendenti, nelle vescicole del tonoplasto isolate dalle foglie, ha confermato che la presenza della proteina antiporto Na+/H+ è responsabile dell’incremento del tasso di scambio Na+/H+.

(A) Scambio H+, Na+-dipendente; (B) Scambio H+, K+-dipendente. -L’aggiunta di Monensis (mon), un antiporto artificiale Na+/H+, o Nigericin (nig), un antiporto artificiale K+/H+, ha eliminato il gradiente di p. H e la fluorescenza è stata recuperata( linee verdi); -Le linee nere indicano i tassi di scambio di cationi/H+ nelle vescicole delle piante TP, mentre le linee rosse indicano il tasso nelle vescicole delle piante WT, dopo l’aggiunta di AMDP. ( Used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology )

• Le vescicole del tonoplasto delle piante TP hanno mostrato tassi di scambio Na+/H+ sette volte più alti di quelli delle vescicole isolate dalle piante WT. • È stato monitorato anche il tasso di scambio K+/H+ che è risultato significativamente più alto nelle vescicole del tonoplasto isolato dalle piante TP. • Questi risultati indicano che l’antiporto vacuolare Na+/H+ è in grado di mediare lo scambio K+/H+, anche se con una specificità più bassa per K+ rispetto a Na+.

• Gli ioni K+ sono coinvolti in molti processi fisiologici. • In condizioni di crescita deficienti di K+, la sua concentrazione nel citoplasma rimane relativamente costante, mentre decresce solo quando la concentrazione di K+ nel vacuolo decresce a valori approssimativamente di 20 m. M. • La diminuzione della concentrazione di K+ nel citoplasma , con il contemporaneo incremento, sempre nel citoplasma, del rapporto Na+/H+, è alla base della tossicità di Na+ nel citoplasma.

• L’evidenza della presenza di un antiporto vacuolare K+/H+ è stata riscontrata nelle frazioni del tonoplasto in diverse piante. • Sebbene il ruolo degli antiporti vacuolari nelle glicofite è ancora da stabilire, la loro ubiquità nelle piante e la loro capacità di mediare il trasporto di K+, suggerisce che l’antiporto vacuolare Na+/H+ potrebbe giocare un ruolo nell’ omeostasi cellulare del potassio.

• Analisi chimiche delle foglie e dei frutti: üSono stati determinati i contenuti di Na+, K+, Cl-, zuccheri e prolina in piante WT e TP cresciute in presenza di 5 m. M di Na. Cl e di 2 linee transgeniche indipendenti cresciute in presenza di 200 m. M di Na. Cl; üÈ importante notare che la comparazione con le piante WT cresciute ad alte concentrazioni di Na. Cl non è stata possibile perché tutte le piante WT in queste condizioni di salinità sono morte.

• Cambiamenti marcati si sono avuti nelle piante transgeniche cresciute ad alta concentrazione di Na. Cl: üIl contenuto di ioni Na+, osservato nelle foglie mature e nelle foglie giovani, è da 28 a 20 volte superiore; un simile incremento è stato evidenziato anche per il contenuto di ioni Cl - : ( Used with permission. Copyright 2002 Nature Biotechnology )

üIl contenuto di ioni K+ nelle foglie mature, giovani e nelle radici delle piante TP cresciute in presenza di 200 m. M di Na. Cl, diminuisce, rispettivamente, 5, 2, 4 volte rispetto a quello delle piante WT e TP cresciute in presenza di 5 m. M di Na. Cl. ( Used with permission-Copyright 2002 Nature Biotechnology ) üIl contenuto di ioni K+ dei frutti transgenici è più alto di quello dei frutti delle piante cresciute in presenza di bassa concentrazione salina.

• Sebbene le foglie delle piante TP hanno acuumulato ioni Na+ fino a quasi l’ 1% del loro peso secco, i frutti hanno mostrato solo un aumento marginale del contenuto di Na+ ed un incremento del 25% del contenuto di ioni K+.

1. Sebbene non è stata osservata una significativa differenza nel contenuto di zuccheri solubili, è stato evidenziato un aumento del contenuto di prolina nelle foglie e nei frutti delle piante TP cresciute in presenza di 200 m. M di Na. Cl, rispettivamente di 3 e 5 volte rispetto alle piante cresciute in presenza di 5 m. M di Na. Cl. ( Used with permission-Copyright 2002 Nature ) üL’accumulo. Biotechnology di prolina in risposta all’alta salinità è documentato; molti organismi procarioti ed eucarioti accumulano prolina durante lo stress osmotico e salino.

• Questi risultati dimostrano: üla capacità delle piante geneticamente modificate di utilizzare acqua salata per crescere; ünonostante l’alto contenuto di Na+ e Cl- nelle foglie delle piante TP cresciute in presenza di 200 m. M di Na. Cl, si è osservato soltanto un marginale incremento del contenuto di questi ioni nei frutti; ül’aumentato accumulo di ioni sodio, mediato dall’antiporto vacuolare Na+/H+, permette alle piante TP di limitare gli effetti tossici del sodio.

WT (5 m. M Na. Cl) OEX 1(200 m. M Na. Cl) Altezza(cm) 124. 0 ± 8. 2 128. 8 ± 9. 5 107. 6 ± 5. 2 Peso fresco(g) Senza frutto 1. 270 ± 103 1. 329 ± 110 1. 123 ± 134 17. 2 ± 1. 3 17. 8 ± 0. 6 18. 4 ± 1. 5 119. 5 ± 13. 4 116. 7 ± 9. 0 105. 7 ± 6. 7 Contenuto di acqua nei frutti (%) 90. 8 ± 3. 2 90. 2 ± 2. 2 90. 7 ± 2. 3 Contenuto solidi solubili (°Brix) 4. 2 ± 0. 6 4. 4 ± 0. 7 4. 2 ± 0. 5 Frutti per pianta Peso frutti(g) -Le piante sono state raccolte 12 settimane dopo la germinazione. -Ogni valore è la media ± la deviazione standard.

• Sebbene i frutti delle piante TP cresciute in presenza di 200 m. M di Na. Cl sono leggermente più piccoli, non sono state osservate differenze significative nel loro contenuto di acqua e di sali solubili totali. • Il numero di frutti per pianta, delle piante WT e delle piante TP, cresciute in presenza di 5 m. M e 200 m. M di Na. Cl, è molto simile.

• È stato dimostrato che durante l’espansione del frutto di molte piante, incluso il pomodoro, più del 90% dell’acqua trasportata nel frutto passa attraverso il floema. • Si ritiene, quindi, che la capacità di mantenere un alto rapporto K+/Na+ nel citosol, dovuta al trasporto dell’acqua attraverso il simplasto, è probabilmente la maggiore responsabile del basso contenuto di Na+ nel frutto. • Queste scoperte suggeriscono la possibilità di produrre piante transgeniche tolleranti la salinità del suolo e che producono frutti commestibili.