PIANTE TRANSGENICHE PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica

PIANTE TRANSGENICHE

PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA Questa caratteristica è alla base della possibilità di creare piante transgeniche la possibilità di rigenerare un’intera pianta da singole cellule differenziate in vitro è possibile ri-generare un organismo vegetale variando il rapporto di auxina e citochinina (ormoni vegetali che regolano proliferazione e differenziamento) • CALLI : ammassi cellulari sdifferenziati propagabili in vitro all'infinito. • GERMOGLI • RADICI

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO Foglia sterilizzata CALLO GERMOGLI RADICI Auxina/Citochina

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO radici Auxina/Citochina germogli Auxina/Citochina

PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE 1) Agrobacterium tumefaciens 2)Bombardamento

Agrobacterium tumefaciens Batterio del suolo Gram. Fitopatogeno che trasforma geneticamente le piante colpite COLPISCE LE DICOTILEDONI (vite, rose, piante frutto carnoso e seme legnoso)

Agrobacterium tumefaciens Plasmide Ti (induttore del Tumore) Contiene il T-DNA (transfer DNA) T-DNA 12 -24 Kb Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante

Agrobacterium tumefaciens Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante Queste sostanze ATTIVANO i geni VIR (7/8) del plasmide Ti L’attivazione dei geni VIR è necessaria per l’integrazione nel DNA della pianta T-DNA è trasferito come molecola lineare a singolo filamento con meccanismo simile a coniugazione batterica Le regioni ripetute alle estremità (25 bp) IMPORTANTI per meccanismo di taglio e integrazione PRIMA: si attivano i geni VIR importanti per trasferimento T-DNA DOPO: si attivano i geni del T-DNA AUXINA-CITOCHINA-OPINA Fonte di Carbonio utilizzabile solo da A. t.

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE Svantaggi: 1) Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta 2) Produzione dell’Opina non è utile per la pianta (dannosa? ) 3) Plasmidi Ti sono grandi (200 -800 Kb) 4) Plasmidi Ti non hanno ORI

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE 2 METODI 1) VETTORE BINARIO Per amplificare il plasmide in E. Coli Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina geni VIR Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO No geni VIR

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE 2) VETTORE COINTEGRATO RICOMBINAZIONE

1) VETTORE BINARIO 2) VETTORE COINTEGRATO

E. coli A. tumefaciens

TRASFORMAZIONE DEL TABACCO

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI Alcuni protocolli elaborati hanno permesso l’utilizzo di A. tumefaciens anche in mais e riso

Bombardamento Utilizzato per la maggior parte delle Monocotiledoni • Trasformazione mediata da microproiettili rivestiti da DNA • Utilizzato per saggi RAPIDI • BASSA frequenza di integrazione stabile ed ereditabile del DNA nel genoma della pianta • Possibilità di inserzioni MULTIPLE Utilizzato per inserire DNA in: • Monocotiledoni • Sospensioni di cellule vegetali • Colture di callo • Embrioni immaturi • Polline di molte piante • Mitocondri e cloroplasti

Bombardamento Particelle d’oro o tungsteno, ricoperte da DNA (precipitato con Ca. Cl 2/spermidina) sono accelerate a 300 -600 m/s con un “cannone da particelle” (polvere da sparo, elio, aria compressa) A questa velocità il DNA supera la parete vegetale e penetra nel NUCLEO Il DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti

Agrobacterium e Bombardamento Infetta solo DICOTILEDONI Introduzione del DNA solo nel NUCLEO Infetta MONOCOTILEDONI DICOTILEDONI EMBRIONI etc Introduzione del DNA anche in cloroplasto/mitocondrio

ALTRI METODI

Preparazione PROTOPLASTO

ORGANISMO MODELLO: Arabidopsis Thaliana

L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO: Le piccole dimensioni Il breve ciclo vitale Il piccolo genoma (più piccolo tra tutte le piante 125 Mb)

L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO: Facilità nel divenire transgenica Notevole disponibilità di mutanti Elevata produzione di semi (1 pianta: 10. 000 semi) d: 0, 5 mm

Utilizzo di GENI REPORTER nelle cellule vegetali trasformate Importante poter rilevare se la trasformazione è avvenuta GFP: Green Fluorescent protein LUCIFERASI GUS: -D-glucuronidasi

GUS: -D-glucuronidasi da E. coli GENE reporter uid. A codifica per GUS Numerosi glucorinidi possono essere usati come substrato della reazione enzimatica: • Colorazione istochimica: X-Gluc • Saggi spettrofotometrici: il p-nitrofenil β-D-glucuronide • Saggi fluorimetrici: il 4 -metilumbelliferil-beta-D-glucuronide

Studio dei PROMOTORI/ENHANCER (promoter trap/enhancer trap) PROMOTOREassente/PROMOTOREminimo Gene REPORTER Per amplificare il plasmide in E. Coli Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina/G 418

ENHANCER TRAP (GUS)

ENHANCER TRAP (GFP)

GAL 4/GFP-ENHANCER TRAP

COLLEZIONE di Arabidopsis GAL 4/GFP-ENHANCER TRAP

Trasferimento di DNA nei CLOROPLASTI Organello necessario per la produzione di Energia. Contiene proprio DNA con genoma circa 105 volte più piccolo del genoma vegetale La maggior parte delle piante superiori contiene nelle cellule fogliari circa 100 cloroplasti. Ogni cloroplasto contine circa 100 copie del DNA del cloroplasto Trasformazione deve avvenire SOLO nel CLOROPLASTO e in TUTTI i CLOROPLASTI UTILIZZO di segnali di trascrizione di tipo PROCARIOTICO

Trasferimento di DNA nei CLOROPLASTI bombardamento Trasformazione con SINGOLO vettore spectinomicina puo’ conferire problemi alle seq omologhe al DNA Resistenza alla spectinomicina Trasformazione con vettore DOPPIO Resistenza alla kanamicina

Produzione di piante transgeniche SENZA MARCATORI Per amplificare il plasmide in E. Coli Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina I GENI MARCATORI (resistenza NEOMICINA/SPECTINOMICINA) POTREBBERO ESSERE TOSSICI e/o ALLERGENICI quando ingeriti Geni per la resistenza agli antibiotici potrebbero passare a batteri della flora intestinale

STRATEGIE per la produzione di piante transgeniche SENZA MARCATORI 1) Utilizzo del GENE MARCATORE e sua successiva rimozione 2) Utilizzo di due costrutti (GENE ESTRANEO + GENE RESISTENZA) Successiva segregazione dei due costrutti 3) Abolizione dell’uso del GENE MARCATORE: screening per PCR