INMOVILIZACIN POR ENTRECRUZAMIENTO CROSSLINKING Prof J M Snchez

INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

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üModificaciones unipuntuales de interés üObjetivo: hacer a la enzima insoluble en disoluciones acuosas. üUno de los métodos más tradicionales: ü UNIÓN COVALENTE DE UN POLÍMERO ANFIPÁTICO. üEl más habitual: monometoxipolietelienglicol (m. PEG) üPeso molecular variable. El mas usado: sobre 5 k. Da. üDependiendo del grado de modificación, se consigue la total insolubilidad en agua. üEste grado debe ser controlado cuidadosamente, pues puede conducir a la pérdida de actividad. üLa unión se suele hacer sobre lisinas. Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Uno de los más empleados. A través de TCT (cloruro cianúrico) Debe controlarse bien Copolímero con anh. succínico Enlace amida estable A través de un carbamato Se sigue fácilmente la activación. Oxidación del m. PEG Se activa el grupo ácido con Nhidroxisuccinimda. Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

üOtra característica interesante de esta metodología: SE OBTIENEN DERIVADOS SOLUBLES EN CIERTOS DISOLVENTES ORGÁNICOS: Benceno, tolueno y clorados (cloroformo, 1, 1, 1 -tricloroetano, tricloroetileno) LA CATÁLISIS SE HACE HOMOGÉNEA. üInmovilización en disolventes orgánicos? Siempre que se pueda recuperar el derivado. Recuperación: Añadiendo disolv. muy apolares (hexano, éter de petróleo) se produce la pptación. Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

REACTIVOS ENTRECRUZANTES DIFUNCIONALES Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Cross-Linked Enzyme Aggregates Cross-Linked Enzyme Crystals Cross-Linked Enzymes Crosslinked Spray-Dried Enzymes Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Cross Linked Enzymes (CLE) A comienzos de los años 60 se describe por primera vez que el tratamiento de enzimas con reactivos difuncionales (fundamentalmente glutaraldehído) originaba derivados insolubles con retención de actividad (CLEs) Al mismo tiempo, se aumentaba la termoestabilidad (sobre todo en enzimas multiméricas), pero se necesitan unas condiciones muy delicadas (cantidad crosslinker, T, p. H, fuerza iónica). El material obtenido era gelatinoso, y se intentó el entrecruzamiento con otras moléculas para aumentar propiedades mecánicas, Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR Centro activo Enzima nativa Enzima desplegada (desnaturalizada) Enzima estabilizada por un entrecruzamiento intramolecular Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Cross Linked Enzyme Crystals (CLECs) Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Proceso de cristalización Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Entrecruzamientos más habituales Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

Ventajas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Mayor actividad por unidad de volúmen (partículas uniformes, microporosas, formadas por sólo moléculas de enzima pura, lo que implica la máxima posible concentración de enzima) Gran actividad específica Fácil separación del medio de reacción, lo que facilita su reutilización. Buenas propiedades mecánicas y termoestabilidad, así como resistencia a disolventes orgánicos. No producen contaminación medioambiental. No requieren soportes muy caros Resistentes a la proteolisis Desventajas 1. 2. 3. Dificultad de cristalización Problemas de difusión (debe miminizarse el tamaño del cristal) Alto precio Prof. J. M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

CLECS Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

CLECS Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

Cross Linked Enzyme Agreggates (CLEAs) Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

POSIBILIDADES Crosslinked Enzyme Crystals CLECs Crosslinked Enzyme Aggregates CLEAs Enzimas puras y cristalinas Enzimas con trazas de impurezas Necesidad de enzima pura Coagregación de enzimas Estabilización de proteinas multiméricas Agregación de enzima y polímero Estabilización de enzimas multiméricas Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

ESQUEMA DE CLEAs + precipitante PEG Sales, disolventes CLEAs entrecruzante Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

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ENTRECRUZAMIENTO INTERMOLECULAR lento rápido Enzima multimérica Enzima disociada (reversible) Enzima desnaturalizada (irreversible) Muy lento Enzima multimérica entrecruzada Enzima desnaturalizada entrecruzada (irreversible) Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN üEs el método más sencillo y antíguo (células de acetobacter adsorbidas sobre palos de madera para obtener vinagre por fermentación-1815) üSe puede emplear tanto para células como para enzimas. üLas fuerzas de unión son débiles: üVan der Waals üInteracciones iónicas üEnlaces de hidrógeno. üSe producen fácilmente desorciones debido a: üvariaciones concentración de sustrato. üCambios de p. H ücambios de T üalteración de la fuerza iónica. Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN üSoportes típicos: ücarbón activo üsílice, alúmina, titania, . . . üTierra de diatomeas (Celite) ücelulosa üresinas sintéticas üCPG (controlled pore glasses). üLa mayoría de las enzimas se unen mejor a soportes polares üLas lipasas se unen mejor a superficies hidrofóbicas üMÉTODO MUY RECOMENDADO PARA ENZIMAS EN DISOLVENTES ORGÁNICOS (NO DESORCIÓN) Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN üUnión iónica es bastante habitual. üSe usan a nivel industrial resinas intercambiadoras : ücatiónicas ücarboximetilcelulosa üamberlite IRA üaniónicas üdietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosas) üresinas Sephadex üSe precisa un exquisito control del p. H de la inmovilización : Coherencia con la carga neta enzimática como consecuencia del p. Ka. Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN üMetodologías empleadas: ümétodos en batch üayuda de precipitación (ej acetona, isopropanol) ümétodos en columna üplug flow ülecho fluidizado üREGLA DEL DIÁMETRO DE GIRO (spin diameter) Prof. J. M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

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