ADN ftal dans le sang maternel J M

ADN fœtal dans le sang maternel > J. M. COSTA Laboratoire Cerba Colloque ATC Aix-en-Provence 20 Septembre 2010

Diagnostic prénatal in utero en France : rappels Principales indications • Anomalies chromosomiques • Maladies et caractéristiques génétiques – Mucoviscidose – Hémoglobinopathies – Amyotrophie spinale – Achondroplasie… • Foetopathies infectieuses – Toxoplasmose – Cytomégalovirus, parvovirus B 19, varicelle… Données Agence de la Biomédecine année 2007 94. 375 2. 881 6. 443

Diagnostic prénatal in utero en France : rappels Diagnostic des anomalies chromosomiques : 94. 375 Indication • Age maternel ( 38 ans) 30. 677 • Marqueurs sériques 38. 377 Þ Soit de 345 à 690 pertes fœtales pour 895 trisomies 21 détectées Données Agence de la Biomédecine année 2007

Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Les acides nucléiques circulants ou cellules fœtales ?

ADN fœtal plasmatique Physiopathologie • Origine cellulaire: les cellules trophoblastiques • Apparition précoce dans la circulation maternelle ≈ 5 -6 SA • Augmentation de la concentration tout au long de la grossesse • Disparition rapide (< 48 h) après accouchement (1/2 vie 16 min) • Pas de persistance après grossesse

ADN fœtal plasmatique Méthode d’étude de concept simple • Recueil du plasma/sérum • Extraction des acides nucléiques • Analyse par biologie moléculaire

ADN fœtal plasmatique Difficultés et limites Analyse moléculaire • Séquençage… • MLPA, QF-PCR… • Caryotype moléculaire (CGH-array, SNP-array)

ADN fœtal plasmatique Difficultés et limites d’analyse • Ne représente que 3 à 6% de l’ADN plasmatique • Quantité faible au 1 er trimestre : 20 -30 Geq/ml • Analyse restreinte à la détection de séquences absentes du génome maternel

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel Y X Détermination du sexe fœtal : Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gène. SRY)

Diagnostic de sexe fœtal par analyse de l’ADN fœtal circulant Sérum positif (x 4) Sérum négatif (x 4)

Détermination du sexe foetal Intérêts – Maladies génétiques liées à l’X – – Hyperplasie congénitales des surrénales – – Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque) (déficit en 21 -hydroxylase) Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile) Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie – Aide à la prise en charge.

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel RHD+ RHDGénotypage RHD fœtal : séquences dérivées du gène RHD

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du système rhésus 3’UTR Gène RHD Gène RHCE 98 % d’homologie au niveau nucléotidique 92 % d’homologie au niveau protéique

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype Rh. D-négatif + + + del del 42 % Phénotype Rh. D-positif 85 % 43 % Phénotype Rh. D-négatif 15 %

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD Génome paternel Rh. D-positif Ex 5 Ex 7 Ex 10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus Rh. D-positif Fœtus Rh. D-négatif

Génotypage RHD fœtal non invasif Indications – Les patientes Rh. D-négatives allo-immunisées • – Eviter un geste invasif qui risque de réactiver l’immunisation Les patientes Rh. D-négatives devant subir un geste invasif • Eviter une prophylaxie anti-D inutile • Mise en place d’une prophylaxie immédiate Intérêt: environ 30% des fœtus sont Rh. D-négatifs o Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang o Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités) o Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004; 111: 8982 - 902). Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter: – 278 femmes en l’absence de génotypage – 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques (ou caractéristique génétique)? Un défi technologique majeur-1 ü Délétion/insertion, réarrangement complexe and expansion de triplets : IMPOSSIBLE (? ) ü Détection de mutation ponctuelle: ENVISAGEABLE … si développement de techniques sensible de détection de séquences minoritaires • Real-time PCR (PNA, allele-specific…) • PCR-d. HPLC • PCR-High Resolution Melting • PCR et primer extension (MALDI-TOF)….

Détection d’une population minoritaire d’allèle muté: exemple de la PCR-HRM Proportion de l’allèle muté au sein d’un background « sauvage » 5% 2. 5% 1% 0%

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus Mutation de novo : achondroplasie Recherche de la mutation G 380 R du gène FGFR 3 Ce qui va changer ? (validation clinique en cours) • Complément à l’analyse échographique Ce qui pourrait se faire ? • • • Hypochondroplasie Nanisme thanatophore Syndrome d’Apert

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus K 1 K 2 SNP paternel : génotypage KEL (K 1) Recherche du variant Thr 193 Met du gène KEL Ce qui va changer ? (validation clinique en cours) • Plus de recours à l’amniocentèse chez les patientes alloimmunisées pour évaluation fœtale Ce qui pourrait se faire ? • • • Génotypage plaquettaire (HPA 1…) Diagnostic des maladies autosomiques dominantes (paternelle) Test de paternité

Diagnostic prénatal non invasif des anomalies chromosomiques (trisomie 21)? Un défi technologique majeur-2 ü Remaniements chromosomiques complexes: IMPOSSIBLE (? ) ü Aneuploïdies (trisomie 13, 18 et/ou 21) : POSSIBLE … par quantification du nombre de chromosomes du fœtus : • Marqueurs non spécifiques • Marqueurs spécifiques du foetus: ARN (fœtaux) placentaires ou marqueurs épigénétiques

ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification de marqueurs NON-SPECIFIQUES Chr 21 mère Chr 21 foetus Foetus Euploïde Foetus T 21

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Dosage chromosomique relatif (RCD) par Digital PCR

ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification par « massively parallel sequencing » reads “bridge “by synthesis” amplification” “PCR emulsion” “by ligation” Single molecule amplification Massive parallel sequencing chromosomes

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par « massively parallel sequencing » 18 patientes (terme médian: 18 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés 15 patientes (terme médian: 14 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par « massively parallel sequencing » • Avantages • Démonstration pour la détection des trisomies 13, 18 et 21 • Approche indépendante de polymorphismes • Inconvénients • Coût et quantité de données générées (stockage) • En l’état actuel, formats inadaptés à un haut débit

ADN/ARN fœtal plasmatique et trisomie Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ARNs placentaires Chr 21 Foetus euploïde Foetus T 21

ARN fœtal circulant et trisomie Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs Mass. ARRAY® (Maldi-Tof) ACGGGATAAATATCGACTC 5866. 8 Da T C CGGGATAAATATCGACTC 6035. 0 Da C CGGGATAAATATCGACTC 5762. 8 Da CGGGATAAATATCGACTC 5359. 6 Da

ARN fœtal circulant et trisomie Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs 57 patientes fœtus à caryotype normal (mean gestation 13. 0 weeks) 10 patientes fœtus trisomie 21 Ratio (mean gestation 14. 7 weeks) Sensibilité: 90 % (valeur prédictive négative 96, 5 %)

ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ADN hyperméthylé Chr 21 Chr. Ref Foetus euploïde Foetus T 21

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par dosage chromosomique relatif Ratio de HLCS /ZFY ADNs hyperméthylés 29 patientes (1 er, 2 nd and 3ème trimestre) Tous les cas (5) correctement identifiés

Aspects règlementaires L’analyse de l’ADN fœtal circulant est un acte de diagnostic prénatal Ø Laboratoires : Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH Ø Praticiens : Agrément par l’Agence de la Biomédecine Ø Déclaration annuelle des activités diagnostiques