Gnotypage rhsus D ftal partir du sang maternel

Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > J. M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA Paris le 7 novembre 2008

Génotypage rhésus D fœtal Conflits d’intérêts déclarés JM Costa • Laboratoire Pasteur Cerba (Privé): salarié • Laboratoire LFB (Rhophylac®): aucun • Institut Jacques Boy (Free DNA fetal kit®Rh. D): aucun

Diagnostic prénatal à partir du sang maternel L’ADN fœtal sérique ou plasmatique (ADN fœtal libre circulant) Cellules fœtales circulantes

Diagnostic prénatal à partir du sang maternel ADN fœtal libre: difficultés et limites d’analyse • Ne représente que 3 à 6% de l’ADN plasmatique • Analyse restreinte aux séquences « paternelles »

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype Rh. D-négatif + + + del del 42% Phénotype Rh. D-positif 85% 43% Phénotype Rh. D-négatif 15%

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD Génome paternel Rh. D-positif Ex 5 Ex 7 Ex 10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus Rh. D-positif Fœtus Rh. D-négatif

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Les bases moléculaires du système rhésus Sensibilité Allèle RHD+ Allèle RHD Neg « classique » Allèle RHD- « RHD-CE-Ds» Allèle RHD- « RHD » + Ex 5 ++ Ex 7 +++ Ex 10 + + + - - - + + Caucase Afrique noire 99% 18% <1% 15% <1% 67% Fréquence du phénotype Rh. D-négatif: 15 -17% 3 -5%

Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites Ex 5 Ex 7 Ex 10 Génome paternel Rh. D-positif Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus FAUX-Positif

Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites Génome paternel Rh. D-positif Ex 5 Ex 7 Ex 10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus ? « Unconclusive result »

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites: aucun test ne sera jamais parfait • Les « unconclusive results » Ø variants du gène RHD chez la mère • Les faux-positifs Ø variants du gène RHD chez le foetus Injection inutile anti-D Risque infectieux 0 (? ) Ø Procédure de laboratoire (contaminations) Ø Vanishing twin • Les faux-négatifs Allo-immunisation 13% Ø Procédure de laboratoire (défaut de sensibilité) Ø variants du gène RHD

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Expériences récentes en Europe

Pourquoi faut-il proposer le génotypage RHD fœtal ? Recommandation du CNOGF 2005 Intérêts • Cà marche ! • Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang • Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités) • Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004; 111: 8982 -902) Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter: – 278 femmes en l’absence de génotypage – 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Frein à sa généralisation • Déficit d’information des patientes et des professionnels • Laboratoires – Activité de diagnostic prénatal (génétique moléculaire) Ø Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH Ø Praticiens agréés par l’Agence de la Biomédecine • Coût du test – Remboursement (B 700: 189€ par assimilation diagnostic prénatal) suspendu depuis janvier 2008 (décision CNAM unilatérale) – Sanquin-NL (149€), Pasteur-Cerba-FR (150€), IGBRL-UK (279€) – Haute Autorité de Santé saisie début 2008 – Intérêt économique incertain

Intérêt économique du génotypage RHD foetal systématique? Etude pilote: A. Benachi, N Léticée N, JM Jouannic JM, Y Ville, JM Costa Hôpital Necker-Paris, CHI Poissy, Hôpital Trousseau, Hôpital Américain de Paris Suivi de 101 patientes Rh. D négatives (Caucase. 93, Afr. Nord 7, Antilles 1) – Génotypage fœtal non interventionnel au premier trimestre: terme moyen 13 SA – Pas de prophylaxie systématique à 28 SA – Décompte: RAI, Test de Kleihauer, Groupe, Rhophylac, Soins infirmiers Résultats – Génotypage RHD fœtal – 2 résultats « unconclusive » (Caucase 1, Antilles 1) – 75 patientes à risque (fœtus RHD-positif) – 24 patientes avec fœtus RHD-négatif ( 25%) – Prophylaxie ciblée: 23 patientes – 12 amniocentèses – 11 saignements et traumatismes

Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie systématique Coût moyen par patiente: Prévention ciblée+systématique 1 242€ 2 331€ (+36. 8%) Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Conjoint (à documenter) Détermination du groupe rhésus Couple à risque Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente Rh. D-négative non immunisée Conjoint Rh. D-positif De 12 SA à accouchement • Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer • RAI: 6ème, 8ème mois 27 -29 SA Anti-D 300µg: prévention systématique Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé NNé Rh. D-négatif NNé Rh. D-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? Prévention ciblée 1 Coût moyen par patiente: 242€ 331€ (+36. 8%) 2 Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente Rh. D-négative non immunisée Conjoint Rh. D-positif De 12 SA à accouchement • Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer Coût moyen par patiente: • RAI: 6ème, 8ème mois 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test 27 -29 SA 599€ si génotypage 279€/test Anti-D 300µg: prévention systématique Accouchement A titre de repère Test de Kleihauer Génotypage RHD foetal 19€ PCR Chlamydia UR 27€ PCR Toxo LAMN 169€ X Détermination du groupe rhésus NNé Rh. D-négatif NNé Rh. D-Positif Anti-D 200µg Test commercial RHD en duplicate Test de Kleihauer 104€

Quelle stratégie? Prévention ciblée 1 Coût moyen par patiente: 242€ 331€ (+36. 8%) 2 Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente Rh. D-négative non immunisée Conjoint Rh. D-positif Coût moyen par patiente: De 12 SA à accouchement 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test • Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer 599€ si génotypage 279€/test • RAI: 6ème, 8ème mois Génotypage RHD foetal 27 -29 SA X X Anti-D 300µg: prévention systématique Coût moyen par patiente: Accouchement 331€ si génotypage 46€/test Détermination du groupe rhésus NNé 440€ si génotypage 150€/test 574€ si génotypage 279€/test NNé Rh. D-négatif NNé Rh. D-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? Prévention ciblée 1 Coût moyen par patiente: 242€ 331€ (+36. 8%) 2 Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test 599€ si génotypage 279€/test Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Génotypage RHD foetal Patiente Rh. D-négative non immunisée Conjoint Rh. D-positif De 12 SA à accouchement Coût moyen par patiente: X X X 331€ si génotypage 87€/test • Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer 399€ si génotypage 150€/test • RAI: 6ème, 8ème mois 532€ si génotypage 279€/test 27 -29 SA Anti-D 300µg: prévention systématique Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé Rh. D-négatif NNé Rh. D-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? Prévention ciblée 1 Coût moyen par patiente: 242€ 331€ (+36. 8%) 2 Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Coût moyen par patiente: Détermination du groupe rhésus 331€ si génotypage 22€/test Recherche d’agglutinines irrégulières 464€ si génotypage 150€/test 599€ si génotypage 279€/test Couple à risque Génotypage RHD foetal Taux de Fœtus RHD Neg 25% 33% Conjoint Rh. D-positif Coût moyen par patiente: De 12 SA à accouchement 331€ si génotypage 87€/test 399€ si génotypage 150€/test • Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer 532€ si génotypage 279€/test • RAI: 6ème, 8ème mois X X X Coût moyen par patiente: 27 -29 SA 331€ si génotypage 110€/test Anti-D 300µg: prévention systématique 370€ si génotypage 150€/test Accouchement 501€ si génotypage 279€/test Détermination du groupe rhésus NNé Coût moyen par patiente: 50% Patiente Rh. D-négative non immunisée NNé Rh. D-négatif NNé Rh. D-Positif 331€ si génotypage 155€/test 319€ si génotypage 150€/test Anti-D 200µg 453€ si génotypage 279€/test Test de Kleihauer

Peut-on réduire la demande de génotypage? Phénotypage rhésus CDE du conjoint (B 75: 25€) + + + del Fœtus Rh. D-positif 100% Fœtus Rh. D-positif 50%

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Questions à réponses variables • ADN fœtal sérique ou plasmatique? • Quel délai pour l’acheminement de l’échantillon au laboratoire? • Quel test proposé: 1ère, 2ème ou 3ème génération? • Doit-on contrôler les résultats négatifs? • Doit-on contrôler les résultats sur liquide amniotique si amniocentèse? • A quel terme? • A quelle patiente doit-on proposer le test? – Patientes allo-immunisées – Patientes devant avoir un geste invasif – Toutes les patientes Rh. D négatives

Test de Kleihauer: contrôle de qualité Simmonet et al. Annales de Biologie Clinique 2001 échantillon C: 50 hématies fœtales/ 10. 000 1 2 3 4 Nbre d’injections anti-D 5