TITOLAZIONE VIRALE La quantit di virus detta titolo

TITOLAZIONE VIRALE • La quantità di virus è detta titolo • Il titolo rappresenta la concentrazione del virus/ml • Può essere rilevato mediate vari saggi : saggio delle placche, saggio di trasformazione, saggio per diluizione limite, saggio di emoagglutinazione Titolazione per placche e per diluizione limite: saggi di infettività . il titolo virale può variare a seconda del metodo usato

METODO DELLA DILUIZIONE LIMITE 2 -5 post-infezione (p. i) Vitalita ’ - + Colorante vitale (cristal violetto) 102 103 104 105 106 NI C- Titolo 256 2

diluizioni seriali della sospensione virale adsorbimento 1 ora a 37º rimozione inoculo il terreno semisolido impedisce la diffusione del virus aggiunta di terreno semisolido (agar) incubazione 2 -5 giorni a 37°C colorazione con rosso neutro o cristal violetto visualizzazione e conta delle placche

TITOLAZIONE PER PLACCHE DI VIRUS HSV-1 Diluizione virus N° placche N° medio x 10 -8 10 -6 10 -7 >400 43, 45 44 = 4. 4 titolo virale = 8. 9 x 108 PFU/ml 10 -8 5, 4 4. 5

Altri saggi di infettività • Saggio dei centri di infezione - una modificazione del saggio delle placche in cui le cellule infette vengono mescolate con cellule non infette e seminate in contenitori per colture cellulari utilizzato per cellule persistentemente infette. • Saggio dei foci di trasformazione - misura del potere oncogeno dei virus Forming Units/ml) (il titolo è espresso in FFU/ml: Focus- • Saggio in Immunofluorescenza - l’infezione è visualizzata mediante rilevamento degli antigeni virali con anticorpi specifici (anticorpi primari) e successivo rilevamento del complesso immune con un anticorpo secondario fluorescente ed osservazione al microspopio a raggi UV – il tiolo è espresso in FFU/cell (Fluorescent-Forming Unit/cell) non è particolarmente accurato, – E’ utile per virus che non replicano efficientemente.

Misurazione diretta del n° di virioni Microscopio Elettronico La sospensione virale, mescolata con una quantità nota di sfere di latex, viene osservata al ME. sfere di latex Poxvirus (a forma di mattone)

Particelle virali vs. virioni infettanti rapporto tra il n° totale di particelle virali e il titolo del virus infettante non tutte le particelle virali sono infettanti

Saggio di Emoagglutinazione virale L’adsorbimento del virus sulle emazie costituisce la formazione di un ponte tra i singoli eritrociti (agglutinazione) emazia virus

Saggio di Emoagglutinazione virale presenza di virus assenza di virus (formazione di un bottone di eritrociti sul fondo del pozzetto)

Emoadsorbimento (HAD) HAD negativo HAD positivo