Slection du Top Spermatozode Universit de Lige CPMA

Sélection du Top Spermatozoïde Université de Liège CPMA CHR de la Citadelle S. Perrier d’Hauterive, MD, Ph. D, M. Dubois, O. Gaspard, F. Thonon, C. Jouan, S. Ravet, P. Ruggeri, V. Gridelet and J-M Foidart XIIèmes Journées Liégeoises de Gynécologie-Obstétrique 24 -25 septembre 2009

Reproduction: histoire de rencontres • Fécondation: rencontre des gamètes – Spermatozoïde normal: le top spermatozoïde – Ovule mature: le top ovocyte embryon compétent • Implantation: rencontre embryon et endomètre – Embryon • Développement embryonnaire précoce – Endomètre maternel • fenêtre de réceptivité XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Sperme • Fonctions: 1. Donner une population de spermatozoïdes aptes à féconder l’ovule spermogramme 2. Aptitude pour le gamète de permettre le développement d’une embryon normal et sain apte à s’implanter dégats ADN, MSOME XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Evaluation du sperme • Progrès en andrologie: focus quasi exclusif sur le fécondation de l’ovule: – ICSI (1992): Perte de la sélection naturelle: injection de spermato immatures, immobiles, morpho pathologique ou ADN très fragmenté avec certain succès (Ogura et al. 2005): !!tolérance de la fécondation!! – conséquences de la fécondation des ovocytes avec des spermatozoïdes à l’ADN endommagé ne sont pas connues avec certitude XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Dégats de l’ADN: fragmentation/décondensation Infections Age, erreurs de réplication Exposition aux xénobiotiques: thérapeutique, occupationnel ou mode de vie (pesticides, tabac, styrène, Exposition chaleur Irradiations électromagnétiques: téléphones mobiles!! (De Iuliis et al. , 2009) Stress oxydatif Clivage lié endonucléase Erreurs d’imprinting Spermato défecteux: - protamination défectueuse: décondensation ADN - Apoptose défecteuse (↑ROS) Dégâts ADN -résidus cytoplasmiques (↑ROS) hydrocarbures, polluants, …) Développement a. N Embryon normal Réparation ADN Echec implantation FC a. N chez la descendance XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Dégats de l’ADN • Description d’association de dégats de l’ADN avec: – Réduction taux de G en fécondation in vitro (34%vs 19%), altération développement embryonnaire, ↑FC, faible fertilité en fertilité naturelle ou assistée (Sakkas 1998, Aitken 2001, Duran 2002, Morris 2002, Benchaib 2003, Loft 2003, Virro 2004, Kruger 2004, Tesarik 2006, Libman 2006, ) – Incidence élevée de pathologies dans la descendance: infertilité, cancer, maladie génétique (S Apert) mais R faible pour G 1…Conséquences sur les générations futures? ? XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Dégats de l’ADN spermatique • Physiologiquement et dans certaines limites: mécanismes de réparation de l’ADN endommagé par l’ovocyte (Shimura 2002), mais parfois défectueux: – Dégats étendus, déficits ovocytaires (âge, culture IV, …) (Zheng 2005) – Réparation aberrante (Aitken 1999) • Frydman et al. 2008: bonne réserve ovocytaire ne prévient pas la réduction des TG associée au sperme à fragmentation élevée. XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Fragmentation de l’ADN • Définition: cassures de l’ADN double brin: particulièrement fréquentes dans la population masculine subfertile (Irvine et al. 2000) • Ne constitue pas une mutation mais est un changement pro-mutagène qui peut générer des mutations chez la descendance suite à une réparation inadéquate ou défectueuse • Impact: principalement sur les grossesses et fausses couches, peu au niveau du développement embryonnaire précoce, y compris la fécondation XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Fragmentation de l’ADN • Comparaison hommes fertiles (HF) et infertiles (HI): pas de frag dans sperme à morpho normale chez HF, mais bien chez HI ! (Avendano et al. 2008) • Corrélation entre réduction de la numération, motilité et de la morphologie avec le niveau élevé de fragmentation MAIS…même avec un spermocytogramme normal, un index de Frag >20 -30% peut être observé (Erenpreiss et al. 2008, Moskovtsev et al. , 2009, Varghese et al. , 2009) • Frag >30%: IIU inutiles faire ICSI d’emblée? : capacitation en F in vivo ou FIV class: ↑ROS et aggravation frag/ICSI: accès direct à la réparation ovocytaire mais FIV: cumulus= meilleure sélection! (Bungum et al. 2007) XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Dégats de l’ADN spermatique • Corrélation avec anomalies chromosomiques (aneuploïdies) et fragmentation de l’ADN spermatique dans les cas de tératospermie sévère (Tang et al. , 2009) • Fragmentation: corrélation avec l’âge paternel… (Belloc et al. , 2008, Quant et al. , 2009) XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

TUNEL assay Terminal deoxynucleotidyl transferase (Td. T) mediated deoxyuridine triphosphate (d. UTP)-fluorescein Nick-End Labelling assay 1. Incorporation de nucléotides biotinylés à l’aide de la terminal deoxynucleotidyl transferase au niveau des cassures de l’AND 2. Ajout d’un anticorps anti-biotine couplé à FITC Evaluation de la proportion de spermatozoïdes fluorescents (microscope fluo x 100 sous huile ou FACS) 2. 3. • • • Dapi (bleu) pour coloration noyaux cellulaires et FITC (vert) pour fragmentation Résultats: • < 20%: normal • 21 -30% fragmentation augmentée: sans incidence • 31 -40% fragmentation augmentée: à surveiller!!! • 40% fragmentation très augmentée: TT ! Exclure inflammation ou infection: ↑ROS et ↑Frag XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Décondensation ADN • Cellule somatique : histones Spermatozoïdes : protamines – Condensation plus importante de l’ADN – Protection de l’ADN contre diverses agression, dont certaines responsables de la fragmentation – Ce n’est pas la décondensation en elle-même qui diminue la fertilité (ROSI) • L’ouverture des ponts disulfures interbrins des protamines (P 2), conduit à décondensation de l’ADN: – Impact sur le développement embryonnaire précoce – Si > 28%: pas de grossesse – Pas de résolution du problème via l’ICSI (>< fragmentation: ICSI peut parfois améliorer le développement embryonnaire XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Décondensation ADN • Etude de la dispersion de l’ADN effectuée par la technique de la coloration à la chromomycine et lecture in situ Rouge: normal – Chromomycine A 3 est fluorescente et entre en compétition avec la protamine au niveau des sites de fixation sur l’ADN – Un décondensation >30% est un marqueur de mauvaise qualité de l’intégrité de la double hélice de l’ADN: peut expliquer échecs de fécondation et/ou développement E précoce= CI TT anti-oxydant! Jaune: décondensé XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Stratégie thérapeutique Les deux tests: cassures de l’ADN et qualité de la condensation doivent être réalisés avant tout traitement anti-oxydant • Fragmentation isolée > 30% : antioxydants Vit C (400 mg), vit E (400 mg), bétacarotène (18 mg), Zinc (500 µmol), Sélénium (1µmol) • Décondensation isolée >30% : Traitement par Zinc et vitamines B 6, B 9, B 12 • Fragmentation et décondensation entre 20 et 30%: Zn, vit B et tocophérol • Si les deux valeurs sont élevées (contre indication traitement antioxydants si décondensation élevée) : privilégier le TT de la décondensation: Zn et vit B (et prévoir ICSI) XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Analyse fine de la morphologie • Microscopie électronique: - 20 000à 180000 X - fixation! - purement D - coût!!!! • MSOME: - 6600 à 10 000 X - pas de fixation! - diagnostique et thérapeutique!! XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

MSOME • Analyse fine de la tête spermatique • Corrélation positive avec critères strictes de Kruger : (Oliveira, 2009) (Bartoov, 2002) – Forme: • Ovale, lisse, symétrique – Taille évaluée sur 100 spz normaux: • 4, 75 + 0, 28µm sur 3, 28 + 0, 20 µm – Chromatine: • Normale si 0 ou 1 petite vacuole • Anormale: si 1 ou plusieurs vacuoles occupent plus de 4% de l’aire nucléaire – mais % formes normales Kruger (9%)> MSOME (3; 3%) XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Noyau spermatique Bedford et al, 1973 (x 46000) Vacuoles: petites lacunes claires. -La structure et/ou la composition de la chromatine des noyaux des spermatozoïdes humains est très variable. vacuoles -La chromatine granuleuse peu condensée traduit une immaturité nucléaire -des vacuoles nucléaires de taille et de localisation variables sont régulièrement observées en MET Bisson et David, 1975 XIIe JLGO 2009 17 Dr S. Perrier d’Hauterive

Noyau spermatique • Signification des larges vacuoles nucléaires des spermatozoïdes? – Fragmentation dans spermatozoïdes à larges vacuoles (30%) > spermato Nx (16%) (Franco et al. , 2008) – Décondensation plus élevée dans spermatozoïdes vacuolés (Cohen. Bacrie, 2008) – Spermatozoïdes de morphologie normale: meilleures fonctions mitochondriales, structure de la chromatine, et moins d’aneuploïdes… D’autant plus si pas de vacuoles (Foresta et al. , 2008) XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

L’ICSI • ICSI: – Injection intra-cytoplasmique du spermatozoïde – 2 étapes: • Éliminer les cellules de granulosa • injection de l’entièreté du spermatozoïde dans le cytoplasme de l’ovocyte XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

ICSI et morphologie: • Anomalies de la majorité des têtes spermatiques: ne donnent pas ou peu • Pas de relation entre le % de formes atypiques et les résultats de l’ICSI( car choix du spermatozoïde le plus normal possible ) Le taux de succès de l’ICSI semble néanmoins dépendre de l’aspect morphologique du spermatozoïde injecté • • de grossesses : macrocéphalie, globozoospermie, 0% de têtes normales De Vos et al. , 2003: – morphologie du spermatozoïde injecté en ICSI: influence sur le taux de fécondation, la morphologie embryonnaire(sur 662 cycles) et les taux de grossesses(sur 1667 cycles). Présélection du spz=étape cruciale pour le succès de l’ICSI= IMSI XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

L’IMSI • Microscope inversé avec condensateur de Normaski • Micromanipulateur automatisé • Objectif 100 X en immersion sous huile • Boîtes en fond de verre • Camera • Grossissement total = gross. du microscope (150 x) x gross. du coupleur vidéo (0, 99 x) x gross. de la vidéo (44, 45 x) = 6600 x XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

IMSI • La microinjection de spermatozoïdes avec une forme normale mais avec de larges vacuoles affecte les TG en ICSI et augmente les FC (Berkovitz, 2006, Antinori, 2008, Junca et al. , 2009) • Impact de ces vacuoles sur le développement embryonnaire? – J 3: Non observable: peu de relation avec observation morphologique de l’embryon (Berkovitz et al. , 2006) – J 5: Si 1 grosse vacuole ou plus de deux petites vacuoles: ↓ blastulation (Vanderzwalmen et al. 2008) XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

IMSI 1 Intra-cytoplasmic of morphologically selected sperm injection 1 2 X 300 2 X 6600 XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

IMSI: chromatine normale Pas de vacuole Une petite vacuole XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

IMSI Têtes spermatiques avec vacuoles de tailles différentes XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

IMSI: chromatine anormale X 300 X 6600 XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Indications: Frag/décondensation/IMSI • • • Echecs d’IIU: décision FIV ou ICSI? Infertilités idiopathiques Échecs d’implantation en FIV/ICSI Tératos sévères < 1 -6% (David) Fragmentations élevées (>30%) Fausses-couches itératives Pas encore vraiment codifiées XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Conclusions • Succès de l’implantation embryonnaire: conditionné par l’interaction de gamètes au top: – Qualité et intégrité du spermatozoïde – Qualité de l’ovocyte…qui sera ou non capable de pallier les déficits éventuels, d’assurer le succès du développement embryonnaire précoce • Embryon compétent…pour dialoguer avec un endomètre qui doit être réceptif XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Merci… XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Morphologie Spermogramme Sperme Le sperme- le spermatozoïde • • • Spermatozoïdes: 5% du volume du sperme Vésicules séminales: plasma séminal (40 -60% du vol spermatique-alcalin) Prostate: sécrétion constitue 10 -30% du volume spermatique: protection et amélioration des fonctions spermatiques (Zinc, phosphatases acides, PSA qui liquéfie l’éjaculat) (acide) Glandes de Cowper: contribuent à 2 -5% du volume: neutralisation acidité urine et lubrification urètre. Aspect : opalescent ± opaque; Viscosité: < 2 cm Volume : 2 à 7 ml ; p. H: 7, 2 et 8 (<7, 2 = atteinte vésicule séminale; >8 = atteinte de la prostate) Numération: 20 -200 106/ml (oligozoospermie <20 106/ml) Mobilité (OMS): Critère de type de mouvement : a, b, c ou d. N: a>25%, A+B: 50% Vitalité: >60 % (coloration vitale éosine / nigrosine des SPZ morts (>50%: Nécrozoospermie) OMS: analyse sur 200 spermatozoïdes après fixation et coloration (papanicolaou) Plusieurs critères: David (N >30%) ou Kruger (critères stricts) N>14% Analyse de la morphologie des spermatozoïdes: anomalies de tête, de pièce intermédiaire, de flagelle, gouttelettes cytoplasmiques XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

ICSI et morphologie: • De Vos et al. , 2003: L’injection de spermatozoïdes anormaux s’accompagne: – D’une baisse du taux de fécondation: 60, 7% versus 71, 7% – D’aucune différence dans la morphologie des embryons observés à J 2 ou J 3 – D’une baisse du taux de grossesse: 20, 2% versus 36, 7% – D’une baisse du taux d’implantation : 9, 6% versus 18, 7% XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive

Fragmentation: indications • Pas encore codifiées… – Echec d’ICSI: échec implantation chez femme jeune – FC/échecs implantation itératifs – Infertilité idiopathique: avant PMA: choix IIU vs FIV/ICSI? XIIe JLGO 2009 Dr S. Perrier d’Hauterive