Sinaptik Vezikl Ekzositozu Do Dr Gvem Gm Akay

Sinaptik Vezikül Ekzositozu Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/ Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi

Sinaptik Veziküller • NT salınımında merkezi rol oynayan ~ 40 nm çapındaki organellerdir. • Her presinaptik aksonal buton NT ile doldurulmuş yüzlerce sinaptik vezikül içerir.

Ekzositoz sırasında • Aksiyon potansiyeli presinaptik membranı depolarize ettiği zaman Ca 2+ kanalları açılır • Ca 2+ nöron içerisine doğru giriş yapar • İçeri giren Ca 2+ , sinaptik vezikül ekzositozunu tetikleyerek NT’lerin sinaptik yarığa salınmasına neden olur. • Bu tetikleme Ca 2+‘un sinaptotagmin’e bağlanması ile gerçekleşir.

Ekzositozdan sonra • Veziküller endozitozla hücre içerisine alınır ve geridöşüme uğratılarak tekrar NT ile doldurulurlar.

Vezikül Geridönüşümü • • Çok sayıda paralel yolakla meydana gelebilir: «Kiss-and-Run» «Kiss-and-Stay» «Endozomal aracılı»

Sinaptik Veziküler • Küçük hacimleri nedeni ile sınırlı sayıda protein içeriğine sahiptirler. • Vezikül bileşenlerinin tam olarak fonksiyonları aydınlatılmayı beklemekle birlikte, pekçok vezikül bileşeni 3 temel işleve sahiptir. 1. NT’lerin alınması ve depolanması 2. Vezikül ekzositozu 3. Vezikül endositozu ve geridönüşümü

• Vezikül bileşenlerinin, vezikül biyogenezinde de rol oynadığı düşünülmekle birlikte; veziküllerin nasıl yapıldığı ve büyüklüklerini neyin belirlediği tam olarak net değil.

Membran Füzyonu • Ökaryotik hücreler için evrensel bir süreçtir. • Membranöz organellerin oluşturulması ve füzyonu yaşamsal pekçok sürecin temelini oluşturur. • Hücrelerin kompartmanlar şeklinde organize edilmesi sinaptik iletim, fertilizasyon, immün yanıt vb…

SNARE proteinleri sinaptik vezikül füzyonuna aracılık eder

SNARE proteinlerinin keşfi • Clostridial botulinum ve tetanoz toksinleri • Güçlü nörotoksinler • Presinaptik uca girer ve son derece özgül proteazlar olarak davranarak aksonal buton morfolojisini değiştirmeden membran füzyonunu engellerler

SNARE proteinleri 1. Snaptobrevin/VAMP (R-SNARE) 2. SNAP-25 3. Sintaksin-I Bu 3 protein membran füzyon makinesinin temel bileşenleridir.

• Clostridial nörotoksin çalışmalarından önce gerçekleştirilen in vitro füzyon çalışmaları sırasında «NSF» adı verilen ve membran trafiğinde önemli rol oynayan bir protein tanımlanmıştır • NSF= N-ethylmaleimide Sensitive Factor

• Nörotoxin verileri ışığında staptobrevin, SNAP-25 ve sintaksin proteinlerinin tanımlanmasının hemen ardından bu 3 proteinin birbirleriyle kompleks oluşturduğu ve bir ATPaz olan NSF’nin bu kompleksi bileşenlerine ayırdığı gözlendi. • Bunedenle komlekse SNARE adı verildi • Soluble NSF-Attachment protein Receptor

Hipotez • Trans-SNARE kompleksleri veziküller ve plazma membranı arasında köprü vazifesi görerek veziküllerin membrana yönelip kenetlenmesi için spesifikliği belirlemektedir.

SNARE kompleksi • Yapı olarak son derece stabil • Snaptobrevin ve sintaksinin transmembran domainlerine komşu olan helikal bölgelerinin paralel düzenlenmesi ile oluşur

• SNARE kompleksinin kurulumu enerji açığa çıkarır ki bu enerji membranların füzyonu sırasında membranlarını birbirine yaklaştırıcı güç olarak kullanılır.

trans-SNARE kompleksi • SNARE kompleksi parelel 4 heliks demeti içerir • Hipotez değil

SNARE proteinleri ve Füzyon • «Kurulma ve Ayrılma Döngüsü» şeklinde iş görürler • SNARE kompleksinin oluşması: Füzyon için gerekli gücü sağlamak • SNARE kompleksinin ayrılması: Bir sonraki füzyonda kullanılmak üzere SNARE proteinlerinin hazır olmasını sağlamak

SNARE Döngüsü • Amino-uç Karboksi-uç • Füzyona uğrayacak membranlar arası boşlukta köprü oluşturan trans-SNARE komplekslerinin fermuar gibi kapanması ile başlar • Fermuarın tam kapanması membranda füzyonporunun açılmasına neden olur

SNARE Döngüsü • Porun açılmasından sonra, iki membran tamemen birbiri üzerine çakışmış hale gelir • trans-SNARE kompleksleri, cis-SNARE komplekslerine dönüştürülür. • cis-SNARE kompleksleri daha sonra NSF ve SNAPler tarafından monomerlerine ayrılır.

SNARE Döngüsü • Bu döngüde NSF, SNARE proteinlerini «enerji ile yükler» • Reaktif SNARE proteinlerinin enerjisi, SNARE kompleksinin kurulumu yoluyla füzyon işleminde kullanılır.

SNARE Kompleksinin Kurulumundaki Özgüllük • SNARE proteinleri karakteristik aa dizisine sahiptir – 6 adet heptad tekrarı içeren 60 -70 aa uzunluğunda • Pek çok SNARE proteini 1 adet SNARE motifine sahiptir. • SNAP 25’de ise 2 adet SNARE motifi bulunmaktadır.

• SNARE proteinlerinde bulunan SNARE motifleri, SNARE kompleksinin 4 -heliks sarmal bobin (coiled coil) yapısını oluştururlar

SNARE Proteinleri • SNARE proteinleri içerisinde en basit yapıya sahip olan Sinaptobrevindir • SNAP-25 de 2 adet SNARE motifi ve bir bağlayıcı bölge bulunur. – Bu bölgenin palmitoilasyonu ile membrana tutunur • Sintaksin ise en kompleks yapıya sahip SNARE proteinidir – Korunmuş amino-terminal bölgesi, buna komşu kendiliğinden katlanan Habc domaini, SNARE motifi ve TM çapa domaini içerir

Sintaksin • Genel olarak bakıldığında membrana tutunma domaini ve SNARE motifleri proteinin yaklaşık 1/3’ini oluşturur. • Proteinin büyük bir kısmı ise «non-SNARE» dizilerden oluşmaktadır.

• Kompleksteki 4 -heliks demeti temel olarak hidrofobik etkileşimler sonucu oluşturulur

SNARE Motifleri • Protein dizi analizleri sonucunda SNARE motiflerinin 4 grup şeklinde sınıflandırılabileceği görülmüştür. 1. 2. 3. 4. Qa-SNARE Qb-SNARE Qc-SNARE R-SNARE

• R-SNARE: Transport vezikülü v-SNARE • Q-SNAREs: Alıcı membran t-SNARE

SM Proteinleri • Membran füzyonunda SNARE proteinlerinin son derece önemli partneridirler • Biri veya diğerinin olmadığı koşullarda füzyon meydana gelmez • Yaklaşık 600 aa uzunluğunda evrimsel olarak korunmuş proteinlerdir. • Yay şeklinde tokaya benzer

SM Proteinleri • Sintaksin’lerin amino-ucundaki korunmuş dizi SM proteinleri ile bağlanır

SM Proteinleri • Bu bağlanma SNARE kompleksinin oluşmasına engel değildir. • Bağlanma bölgesi SNARE motiflerini içermez

Sinaptik Ekzositoz için SNARE proteinleri neden SM proteinlerine ihtiyaç duyuyor?

• Net bir yanıtı yok. • SNARE kompleksinin paketlenmesinde rol oynayabileceği düşünülüyor. • «Bu bağlanmanın SNARE komplekslerini uzaysal organizasyonunu sağlıyor ve füzyone olan membranlar arasındaki boşluğun içine doğru kaymalarını engelleyerek kompleksin oluşmasına yardımcı oluyor olabilir» • «Füzyon sırasında doğrudan fosfolipid karışmasını katalizliyor olabilir»

SM Proteinleri • Primer fonksiyonları füzyonu regüle etmek değil, yönetmek • Delesyonları füzyonu ortadan kaldırıyor • Ca 2+, fosforilasyon ve diğer ikincil mesajcılar gibi klasik sinyal iletim mekanizmaları ile düzenlenmiyorlar

SNARE- ve SM-protein kompleksleri • Veziküllerin hedef membranlara tutunmasını stabilize ederek «kenetlenme» de rol oynarlar • Vezikül yönlendirilmesi sırasında, ekzositozdan önce meydana gelmektedir.

SNARE Şaperonları: CSP- α ve Sinükleinler: • Herbir NT salınma olayı, SNARE kopmlekslerinin kurulması ve bu komplekslerin NSF ve SNAPler aracılıyla ayrılması süreçlerini içermektedir. • Belirli bir zaman anında pre-sinaptik uçta yüzlerce katlanmamış veya kısmen katlanmış SNARE-protein molekülleri bulunur. • Bu katlanmamış veya kısmen katlanmış proteinler spesifik olmayan etkileşimlere veya yanlış katlanma olaylarına yatkın SNARE motiflerine sahiptir. • Bu nedenle nöronlarda bu katastrofiyi engelleyecek, yani SNARE proteinlerini işlevsel konformasyonlarında tutacak ve SNARE-kompleks oluşumunu destekleyecek en azından iki şaperon sistemi bulunmaktadır.

• • CSP- α, Hsp 70 ve SGT Sinükleinler Her ikisi de nörodejenerasyon ile ilişkili Yanlış katlanmış ve/veya anormal yapılanma gösteren SNARE proteinlerinin varlığı nöronal sağ kalıma engel olmaktadır.

CSP- α • Evrimsel olarak korunmuş sinaptik vezikül proteinidir • Şaperonlara özgü DNA-J domain içerir. • DNA-K domain içeren Hsp-70 ve tetratrikopeptid tekrar proteini SGT ile kompleks oluşturduğunda, deneysel olarak – Denatüre edilmiş proteinlerin katlanmasına aracılık ettiği – SNAP-25’lerin agregasyonunu engellediği gösterilmiştir.

• Farede CSP-α delseyonu – NT salınmasına hemen etkisi görülmüyor – SNAP-25 lerin ubiquitin aracılı degredasyonunu artıyor – 2 -3 aylıkken nörodejenerasyon nedeni ile ölüyor

Sinükleinler • α-, β- ve Ɣ-sinükleinlerden oluşan bir protein ailesi • α -sinüklein mutasyonları veya aşırı ifadesi Parkinson hastalığı ile ilişkili • Pek çok nörodeneratif hastalıkta gözlenen Lewy cisimcikleri alfa-sinüklein içeriyor

Sinükleinler • Negatif yüklü fosfolipidlere bağlanan küçük proteinlerdir. • CSP-α KO farelerde orta seviyede ekspresyonları bile letal nörodejenerasyonu engelleyebiliyor. • Tüm sinüklein izoformalarının delete olduğu farelerde – Letalite gözlenmiyor – 1 yaştan sonra yaşa-bağlı nörojenerasyon gözleniyor

• α-sinüklein normal olarak SNARE-kompleksinin kurulumuna aracılık eder. • Ancak bu genin duplikasyonu veya triplikasyonunun gözlendiği hastalarda, alfa-sinüklein’in aşırı ifadesi neden nörodejenerasyona neden oluyor?

1. Artmış SNARE-şaperonlanması füzyon dengesini bozacağı için zararlı olabilir 2. α-sinükleinin yanlış katlanması nörodejenerasyona neden oluyor olabilir.

SNARE/SM Protein Füzyon Makinesinin Aktif Zona Montajı • Sinaptik ekzositoz sırasında sinaptik veziküller proteince son derece zengin aktif zona kenetlenir ve füzyon gerçekleşir. • Aktif zonda en az 4 anahtar protein bileşeni bulunmaktadır 1. Munc 13’ler 2. RIM’ler 3. RIM-BP’ler 4. Alfa-riprinler Piccolo/Bassoon, ELKS(CAST)

• CASK, Velis, Mints , endositik iskele proteinleri (intersektin, sindapin, amfifisin, …) • Bu aktif zon proteinleri bütün sinaps türlerinde mevcut – Eksitatör/inibitör – Nöromusküler junction – Ribbon sinapslar

Aktif zon • Pre-sinaptik uçların birbiri ile örtüşen 3 temel fonksiyonuna aracılık eder 1. Sinaptik veziküller, Ca 2+ kanalları ve diğer presinaptik bileşenleri tek bir kompleks şeklinde fiziksel olarak birbirine bağlamak • Hızlı sinaptik iletim için tüm bileşenlerin kolokalizasyonunu gereklidir.

Aktif zon 2. Pre-sinaptik reseptörleri organize ederek NT salınımının pre-sinaptik modülasonuna olanak sağlamak. 3. Kısa- ve uzun-süreli plastik plastisitenin pek çok formuna aracılık etmek.

Munc 13’ler ve RIM’ler • Yapısı en iyi tanımlanmış ve fonksiyonları en iyi anlaşılmış aktif zon proteinleridir • Multidomain protein yapısındadırlar

Munc 13 • Çok sayıda promotor’dan eksprese olan çok sayıda izoformu söz konusudur • Munc 13 izoformlarında – Amino- ucunda C 2 A domaini bulunur. Ca 2+ bağlamaz ve homodimerizasyonda rol oynar – Ca 2+ bağlayan bir merkezi C 2 B domaini – Yönetici MUN domaini – Ca 2+ bağlamayan C 2 C domaini yapısında bulunan diğer domainlerdir.

Munc 13 • Sinaptik vezkülün hazırlanması ve yönlendirilmesi için gereklidir • Ca 2+ ve RIM tarafından sıkı düzenlenmesi söz konusudur • Büyük bir olasılıkla SNARE ve/veya SM proteinleri ile etkileşerek vezikülü yönlendirmektedir

RIM Proteinleri • Munc 13 lerle karşılaştırıldığında domain yapıları daha karmaşıktır • İzoformaları söz konusudur • α-RIM’ler en baskın olan izoformdur

RIM Proteinleri • Amino ucunda bulunan iki bölge ile bir yandan GTPbağlama proteini olan Rab 3 ile diğer yandan da Munc 13’ün C 2 A domaini ile etkileşir. • Eğer RIM varsa Munc 13 homodimer oluşturmak yerine RIM ile Munc 13/RIM heterodimerini oluşturur.

RIM Proteinleri • Merkezi PDZ domaini ile ELKS proteinlerine ve Ca 2+ kanallarına bağlanır • İki adet Ca 2+ bağlamayan C 2 A ve C 2 B domainleri bulunur • Bu domainler arasında yer alan kısa Prolince zengin dizi ile RIM-BP’lere bağlanır • İkinci C domaini ile de alfa- liprine bağlanır • Diğer aktif zon proteinleri ile bağlantıyı sağlayan merkezi bir proteindir.

RIM Proteinlerinin İşlevleri 1. Munc 13’ün «priming» aktivitesini düzenlemek. 2. Ca 2+ kanallarını aktif zona bağlamak Doğrudan: Ca 2+ kanallarına PDZ domainleri aracılığı ile bağlanırlar Dolaylı yoldan: RIM-BP aracılığı ile bağlanırlar

RIM Proteinlerinin İşlevleri • RIM proteinlerinin delesyonları pre-sinaptik membranda Ca 2+ kanallarının kaybolmasına • Aksiyon potansiyeli ile indüklenmiş Ca 2+ girişinin engellemesine neden olur

ÖZET • Sinaptik ekzositoz hiyerarşik olarak organize olmuş bir grup protein aracılığı ile gerçekleşir. • SNARE ve SM proteinleri bu organizasyonun çekirdeğini oluşturur • İşlevselliği için NSF, SNAPler ve spesifik SNARE şaperon proteinleri rol oynar • Diğer aktif zon proteinleri tarafından düzenlenir.