Metdy identifikcie a izolcie novch gnov Funkn klonovanie

Metódy identifikácie a izolácie nových génov • Funkčné klonovanie („priama genetika“) – proteín → AA sekvencia → oligosondy → skríning knižníc – proteín → protilátka → imunoprecipitácia na polyzómoch – proteín → protilátka → skríning c. DNA knižníc • Pozičné klonovanie („obrátená genetika“) – – – – určenie pozície génu v mape kráčanie po chromozóme konštrukcia kontigu hľadanie klonov s kódujúcimi sekvenciami identifikácia klonu s hľadaným génom klonovanie hľadaného génu, jeho charakterizovanie overenie (pacienti) • Kandidátne gény – vyhľadávanie v databázach (bioinformatický prístup) – využitie zvieracieho modelu (myš)

Funkčné klonovanie („priama genetika“) • Východisko: génový produkt (proteín) alebo protilátka k nemu • Štandardný postup: – – – sekvencia AA proteínu preklad z AA do sekvencie DNA (degenerácia kódu!) syntéza degenerovaných DNA oligo-sond skríning c. DNA knižníc pozitívne klony ako sondy pri skríningu genómovej knižnice pozitívne klony v DNA knižnici: overiť na pacientoch • Iná možnosť: imunoprecipitácia na polyzómoch – na polyzómoch: m. RNA a polypeptid na jednom mieste – historicky úspešná (1980 -90), už sa však nepoužíva

Funkčné klonovanie: príprava DNA oligosond AA sekvencia: . . - Ala – Glu – Val – Ser – Ala -. . . GCA GAA GUA AGC GCA. . . GCC GAG GUC AGU GCC. . . GCG GUG UCA GCG. . . GCU GUU UCC GCU. . . UCG. . . UCU 4 x 2 x 4 x 6 x 4 = 3072 x degen. oligo (zmiešané sondy) 6 - 7 AA → 18 – 21 bp postačujúca špecifickosť Sondami skrínujeme c. DNA knižnice (z tkanív, kde sa gén exprimuje) c. DNA kniž. ● ● ● pozit. klony c. DNA testovanie na genómovej knižnici (c. DNA ako sondy)

Príklad génu identifikovaného funkčným klonovaním: gén pre faktor FVIII – hemofília A (Gitschier et al. 1984) purifikácia FVIII z krvi terapeutický FVIII sekvenovanie proteínu (15 AA) expresia v bunkách degenerované oligo-sondy (45 bp) skríning c. DNA knižníc DNA-diagnostika mutácie c. DNA kontig (9 kb) gén (186 kb, 26 E) c. DNA klony skríning g-knižnice

Pozičné klonovanie: určenie lokalizácie génu • Chromozómové prestavby (delécie) – hľadať pacientov s monogénnym ochorením a s chrom. deléciou – subtraktívna hybridizácia • Strata heterozygotnosti (LOH) pri TSG – len pri hľadaní tumor-supresívnych génov – porovnávať STR v DNA z nádoru a z norm. tkaniva (tí istí pacienti) – hľadať STR pri ktorom v nádore nastala LOH • Väzba s lokalizovanými polymorfizmami – – – zhromaždiť väzbovo-informatívne rodiny stanoviť lod-skóre s jednotlivými STR a VNTR nájsť tesne viazané STR pred aj za génom „chromosome walking“ medzi týmito polymorfizmami zostaviť kontig (knižnica usporiadaných klonov)

Klonovanie DNA fragmentov z chromozómovej delécie: „subtraktívna hybridizácia“ Normálna DNA: štiepená RE (napr. Mbo. I) – klonovateľné fragmenty DNA pacienta s deléciou: fragment. mechanicky (ultrazvuk) – neklonovateľné Mbo. I - málo DNA del ultrazvuk - nadbytok DNA denaturácia DNA reasociácia abnorm. – abnorm: neklonovateľné abnorm. – norm: neklonovateľné norm. – norm: klonovateľné! Príklad: CGD a DMD u pacienta „BB“ s deléciou na X-chromozóme: klonovanie obidvoch génov v r. 1986

Hlavné kroky pozičného klonovania väzba s STR genet. mapovanie lokalizácia BAC kontig fyzické mapovanie kandidát. gény skríning génov skríning mutácií mutácia

Hľadanie viazaných STR: väzbová analýza • zhromaždiť väzbovoinformatívne rodiny • typizovať STR markery so známou lokalizáciou • pre každý marker vypočítať lod-skore • lod-skore >3, 0 → väzba • → poznáme lokalizáciu

Kontig: súbor prekrývajúcich sa klonov z genómovej knižnice Vektory: YAC – yeast artificial chromosomes BAC – bacterial artificial chromosomes kontig

YAC: yeast artificial chromosome • CEN – centroméra ARS – ori TEL – teloméra URA, TRP – selekč. markery • Inzerty 100 – 700 kb • transformácia buniek S. cerevisiae ↓ selekcia ↓ klony, knižnica ↓ kontig • • •

BAC: bacterial artificial chromosome

Chromosome walking: „kráčanie po chromozóme“ dve genómové knižnice, K 1 a K 2, každá získaná iným RE: 1 3 knižnica 1 5 knižnica 2 2 4 M 1 gén M 2 chrom. DNA smer „kráčania“

„Chromosome walking“: kráčanie po chromozóme

Konštrukcia kontigu L M kontig klonov od L ku M BAC (alebo YAC)

Kontig prúžku 8 q 23 (20 c. M)

Hľadanie génu na kontigu • Ako identifikovať inzert s génom: – – – „Zoo-blotting“ identifikácia Cp. G ostrovčekov klonovanie pomocou Cp. G ostrovčekov skríning c. DNA knižníc „exon trapping“ sekvenovanie • Ako identifikovať na tomto inzerte hľadaný gén: – kandidátne gény (bioinformatika, databázy. . . ) – homológia s myším modelom – skríning mutácií u pacientov (SSCP, DGGE. . . )

„Zoo-blotting“: hybridizácia inzertu s DNA rôznych živočíchov • Použitie: skríningové vyhľadávanie klonov (z knižnice), obsahujúcich kódujúcu sekvenciu (gén alebo jeho časť) • Princíp: kódujúce sekvencie sú obyčajne evolučne konzervované • Ak nevznikne hybridizačný signál: inzert asi neobsahuje kódujúcu sekvenciu

Identifikácia klonov s Cp. G ostrovčekmi (Bird et al. , 1986) Cp. G ostrovčeky: – – – Inzert: C nemetylovaný (inde v genóme C pred G takmer vždy metylovaný) dĺžka 1 - 2 kb časté pred „housekeeping“ génmi (asi 20 x častejšia ako inde) Hpa. II (rozpoznáva CCGG, ak C je nemetylovaný) Hpa. II štiepi Cp. G ostrovy na krátke fragmenty (HTF) tie možno detegovať elektroforézou (séria pruhov) ellfo Cp. G ostrov gén RM Hpa. II : Obmedzenie: Cp. G ostrovy sú len u asi 50% génov HTF

Klonovanie / PCR Cp. G ostrovčekov (Patel et al. 1991) Cp. G ostrov prvý exón Alu gén štiepenie Not. I (GCGGCCGC) ligácia Not. I linkera Alu-primer PCR: Not. I linker + Alu primer PCR produkt obsahuje exón Predpoklady: skríning c. DNA knižníc - pred génom je Cp. G ostrov - v 1. intróne génu je Alu

Amplifikácia exónu: „exon trapping“ „trapping“expresný plazmid s inzertom, obsahujúcim exón 1 cicavčie bunky intrón inzert s exónom promotor. transfekcia cicavčích buniek rezist. exón 2 intrón upravená m. RNA: amplifikovaný „zajatý“ exón c. DNA: transkripcia exón 1 RT plus RT PCR + PCR „zajatý“ exón + processing exón 2

Príklad pozičného klonovania: gén CFTR – cystická fibróza Chromozóm 7 polymorfizmus c. M COL 1 A 1 DOCR 1 PON met. D met. H CF gén (CFTR) 79 A 7 c 22 TCRB 19 15 5 <1 <1 chrom. walking; kontig <1 4. 5 10

Cystická fibróza: kontig, obsahujúci CFTR gén posledné „kroky“ : F. Collins et al. , 1989

CFTR gén, jeho produkt, mutácie a CF

Prvých 10 rokov pozičného klonovania (vybrané ochorenia) rok 1986 1989 1990 1991 1993 1994 1995 ochorenie lokalizácia Duchenne sval. dystr. retinoblastóm cystická fibróza neurofibromatóza Wilmsov tumor fam. polyposis coli syndróm frag. X myotonická dystrofia Hutingtonova chorea tuberózna skleróza achondroplázia karcinóm prsníka spinálna sval. dystrófia Xp 21. 3 13 q 14 7 q 31. 2 17 q 11. 2 11 p 13 5 q 21 Xq 27. 3 19 q 13. 3 4 p 16 16 p 13 4 p 16 17 q 21 5 q 13 gén chrom. abnorm DMD RB CFTR NF 1 WT 1 APC FMR 1 DMPK HD TSC 2 RGFR 3 BRCA 1 SMN 1 del. X(p 21. 3) del(13)(q 13. 1 -q 14. 5) žiadna translokácie 17 del(11)(p 14 p 13) del(5)(q 15 q 22) fragilné miesto žiadna žiadna