DNA diagnostika Klasick dg metdy biochemick funkn a

DNA diagnostika Klasická dg. metódy biochemické funkčné a morfologické dôsledky chybného génu Obmedzenia klasickej dg. ontogenetická špecifita tkanivová špecifita neprítomnosť príznakov u heterozygotov heterogenita

DNA diagnostika Analýza DNA Nezávislosť od ontogenézy - predklinická a prenatálna dg. Nezávislosť od tkaniva – leukocyty, choriové klky, plodová voda, parafínové bločky Detekcia heterozygotov Diferenciálna dg. - neurodegeneratívne a nervovosvalové ochorenia, FRA-X, nesyndrómová hluchota, . . Citlivosť – preimplantačná dg. po in vitro fertilizácii Rýchlosť Jednotná metodika

DNA diagnostika Informácie z analýzy DNA: prítomnosť resp. neprítomnosť špec. úseku DNA dĺžka tohto úseku sekvenčné zloženie tohto úseku (do určitej miery) Spôsoby DNA diagnostiky 1. Priama DNA dg. 2. Nepriama DNA dg.

1. Priama DNA diagnostika Princíp: detekcia mutácie v príslušnom géne zodpovednej za ochorenie Podmienky priamej DNA dg. : detailné znalosti o príslušnom géne znalosť mutačného spektra znalosť distribúcie mutácie v danej populácii

Výhody priamej DNA dg. : Nulové riziko rekombinácie Vyšetrenie len pacienta Priama detekcia prenášačov Diferenciálno-diagnostická hodnota (heterogenita) Obmedzenia: Detailné znalosti o príslušnom géne Veľký počet mutácií (napr. CF)

A. Delécie -1 bp až 10 – 100 bp prejav na DNA úrovni a. Skrátený fragment – Príklad: Cystická fibróza (CF) Dedičnosť: AR Metóda: PCR 99 bp 96 bp

B. Substitúcie – bodové mutácie Príklad – fenylketonúria (PKU) Dedičnosť - AR Názov mutácie R 408 W mutácia vytvorí restrikčnné miesto R 261 Q mutácia eliminuje restrikčné miesto IVS 12 nt ACRS – PCR vytvára RM pre restriktázu – štiepia sa alely bez mutácie

B. Substitúcie – bodové mutácie Príklad: Primárny kongenitálny glaukóm (PCG), mutácia E 387 K Dedičnosť: AR Metóda: PCR s alelovo-špecifickými primermi (ARMS) M – PCR s mutáciou N – PCR bez mutácie ? Kontrolný fragment M N M N M N neg. kon.

Analýza mutácii v CF géne pomocou kitu Elucigene CF 29 PCR prebieha v 4 reakciách – analýza 29 najčastejších mutácií Metóda –Multiplex ARMS test A B C D Kontrolné fragmenty Mutácie Delta F 508 R 117 H

D. Inverzie – Hemofília A, dedičnosť - XR prejav – zmenená dĺžka fragmentov metóda detekcie - PCR 12 kb 11 kb 10 kb Marker 9, 5 kb

F. Prítomnosť špecifickej sekvencie Pohlavie – X a Y špecifické sekvencie metóda detekcie - PCR SM XX XY SM 112 bp Y 106 bp X

2. Nepriama DNA diagnostika Princíp: identifikácia a sledovanie segregácie mutácie v danej rodine pomocou úzko viazaného DNA polymorfizmu Potrebné informácie modelové (typ dedičnosti daného ochorenia, AD, AR, XR. . ) špecifické informácie – získané analýzou DNA polymorfizmu v danej rodine (fáza väzby) Podmienky nepriamej DNA dg. : genetická homogenita a jednoznačná klinická dg. – kauzálne mutácie v tom istom géne informatívnosť rodiny – možnosť stanovenia väzbových vzťahov v rodine (určiť ktorá alela polymorfizmu je asociovaná s mutáciu v danej rodine) úzka väzba s polymorfizmom (do 5 c. M)

Princíp nepriamej DNA diagnostiky Autozomálne recesívny typ dedičnosti d – mutovaná alela D – normálna alela d M 2 D D M 1 d M 2 M 1, M 2 – alely polymorfizmu

Princíp nepriamej DNA diagnostiky Autozomálne dominantný typ dedičnosti D – mutovaná alela D d d – normálna alela M 1 M 2 M 1 M 1, M 2 – alely polymorfizmu

Princíp nepriamej DNA diagnostiky X recesívny typ dedičnosti d – mutovaná alela D – normálna alela D d D M 2 M 1 ? ? ? M 1, M 2 – alely polymorfizmu ? D M 2 ?

Výhody nepriamej DNA dg. Aplikácia pri ochoreniach, u ktorých nepoznáme ich molekulárnu podstatu ani gén, ktorý mutuje Stačí, ak sa stanoví väzba ochorenia s určitým DNA polymorfizmom Pri niektorých ochoreniach je jedinou metódou DNA dg. (veľa mutácií rôzneho typu) Nevýhody nepriamej DNA dg. Nestačí len vyšetrenie pacienta Dg. možná až po stanovení genetickej väzby Riziko rekombinácie

Princíp rekombinácie Rekombinančná frekvencia – miera vzdialenosti 2 lokusov D M 1 1 c. M = 1% rekombinančnej frekvencie d M 2 D d M 2 M 1 rodič meióza gaméty

Príklady informatívnosti rodín pri nepriamej DNA dg. Autozómovo dominantná dedičnosť VNTR STR polymorfizmus informatívny čiastočne informatívny neinformatívny

AD – úplne informatívna rodina A B

AD – čiastočne informatívna rodina A ? B ?

AD – neinformatívna rodina ?

Príklady informatívnosti rodín pri nepriamej DNA dg. Autozómovo recesívna dedičnosť informatívny čiastočne informatívny neinformatívny

AR – úplne informatívna rodina A B

AR – čiastočne informatívna rodina A B ? ? C Post. alebo zdravý? ? Postihnutýalebo prenášač? Zdravýprenášač? Postihnutýalebo prenášač?

AR – neinformatívna rodina A Zdr. , post. , prenášač? ? B ? Zdr. , post. , prenášač?

XR – rodina úplne informatívna A B

XR – neinformatívna rodina