ZOELEKTRK KTRME YNTEM LE KAZEN PROTENNN STTEN AYRILMASI

İZOELEKTRİK ÇÖKTÜRME YÖNTEMİ İLE KAZEİN PROTEİNİNİN SÜTTEN AYRILMASI 09056022 09056024 09056025 09056028 ÖZGE BULAT DENİZ UZUNOĞLU TÜLAY MERVE TEMEL SEDEF KAPTAN

SUNUM İÇERİĞİ 1. DENEYİM AMACI 2. GİRİŞ (TEORİK BİLGİ) 2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 1. p. H Değişimi ile Çöktürme 2. 1. 2. İyonik Şiddeti Düşürerek Çöktürme 2. 1. 3. İyonik Şiddeti Artırarak Çöktürme (Salting-out) 2. 1. 4. Organik Çözücüler ile Çöktürme 2. 1. 5. Organik Polimerler ile Çöktürme 2. 1. 6. Denatürasyon ile Çöktürme 2. 2. izoelektrik nokta tayini 3. DENEYSEL YÖNTEM 3. 1 Deney koşulları 3. 2 Deneyin Yapılışı 3. 3 Güvenlik Koşulları 4. DENEY VERİLERİNİN SAPTANMASI 5. DENEY SONUÇLARI VE YORUM 6. KAYNAKLAR

1. DENEYİN AMACI Protein çöktürme yöntemlerinin prensipleriyle birlikte öğrenilmesi ve protein karışımındaki belirli bir proteini ayırabilmek adına bu proteinin özelliklerine uygun bir çöktürme yönteminin seçilebilmesini sağlamak deneyimizin amacıdır.

2. GİRİŞ(TEORİK BİLGİ) Protein saflaştırmanın amacı sadece saf protein elde etmek değil aynı zamanda daha sonraki çalışmalar için kullanılabilecek bir protein preparatı hazırlamaktır. Bu çalışmalar; proteinin aktivitesinin araştırılması ve bu aktiviteden biyoteknolojik üretim, analitik veya terapötik amaçla yararlanılmasına yönelik olabileceği gibi, protein yapısının veya yapı-fonksiyon ilişkisinin araştırılmasını da hedefleyebilir. İlgili proteinin diğer proteinlerden ayrılmasında veya proteinlerin deriştirilmesinde kullanılan çöktürme işlemi, proteinleri saflaştırma işlemlerinin çoğunda kullanılmaktadır. Protein molekülünün yüzeyindeki hidrofilik ve hidrofobik grupların dağılımı proteinlerin çeşitli çözücülerdeki çözünürlüğünü etkiler. Proteinlerin bu özelliklerinden yararlanılarak amaca uygun olarak farklı şekillerde çöktürme işlemleri yapılır. Bunlar p. H, ısı, organik çözücüler, organik polimerler ve yüksek tuz derişiklerinde çöktürme işlemleridir.

KAZEİN Yalnız sütte bulunan bir maddedir. Sütün en büyük protein kısmını teşkil eder. Süt proteininde %80 civarındadır. Proteinli maddeler, serbest yağ asitleri, süt yağı sütün yüzey aktivitesini belirler. Kazein oranının yükselmesiyle yüzey gerilimi azalır. Kazein asit yada rennin enzimi ile çöktürülebilir. Bu şekilde kesilen süt suyunda ısı ile denatüre olabilen diğer proteinler kalır. Ayrıca süt Na. Cl ile doyurulursa da kazein çöker ve süzüntüde albümin ve globülin bulunur.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 1. p. H Değişimi ile Çöktürme Çözeltinin p. H değerini proteinin izoelektrik noktasına (p. I) yakın ya da eşit duruma getirmektir. Bu işleme izoelektrik çöktürme denir. İzoelektrik noktada protein yüzeyindeki negatif ve pozitif yükler birbirlerine eşit olacaklardır ve benzer moleküller arasında artık elektrostatik itmeler oluşmayacaktır. Bu moleküller arasında belki elektrostatik çekimler oluşacak ve bu da proteinlerin çökmesi ile sonuçlanacaktır.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 2. İyonik Şiddeti Düşürerek Çöktürme Bazı proteinler çözeltinin iyonik şiddetinin belirli bir değerin altına düşürülmesi ile çöktürülebilir. Bu nadiren uygulanan bir yöntemdir ve ham ekstratların kullanılma durumlarında gerçekleştirilebilir. İyonik kuvvet sadece su ilavesi ile düşürülebilir. Böylece konsantrasyon azalırken genelde çözünürlük artmış olur. Düşük iyonik şiddet ile çöktürme işleminin gerçekleşmesi izoelektrik noktada ya da izoelektronik nokta civarında daha olasıdır.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 3. İyonik Şiddeti Artırarak Çöktürme (Saltingout) Nötral tuzların ortama giderek artan miktarda eklenmesi ile çöktürme, kullanılan en yaygın yöntemdir. Çöken protein genellikle denatüre olmamaktadır ve aktivitesi de pelletin yeniden çözülmesi ile birlikte ortaya çıkmaktadır. Burada çökmenin sebebi izoelektrik çökmenin sebebinden farklıdır ve bu nedenle bu iki yöntem aşamalı saflaştırmalar için sıra ile uygulanır.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler Salting-out protein yüzeyinin hidrofobik yapısına bağlıdır. Suyu sevmeyen gruplar genellikle proteinin iç kısmında bulunurlar ancak bazıları parçalar halinde protein yüzeyinde yer alırlar. Su molekülleri bu gruplar ile temasa zorlanır ve bunu gerçekleştirirken düzenli hale gelir. Sisteme tuzlar eklendiğinde su, tuz iyonlarını çözer ve tuz derişimi arttıkça su proteininin çevresinden ayrılarak hidrofobik parçaları açıkta bırakır. Bir protein üzerindeki bu hidrofobik parçalar diğer bir protein üzerindeki hidrofobik parçalar ile etkileşebilir ki bu da yığışım olayıyla sonuçlanır.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 4. Organik Çözücüler ile Çöktürme Organik çözücünün ilavesi çözeltinin dialektrik sabitini ve dolayısıyla çözme kuvvetini düşürmektedir. Böylece proteinin çözünürlüğü azaltılmış olur ve elektrostatik çekimler etkisi ile agregasyon meydana gelebilir. Denatürasyonu minimuma indirmek için organik çözücülerle çöktürme işlemi 0°C’de veya altındaki sıcaklıklarda gerçekleştirilmelidir. Daha yüksek sıcaklıklarda protein konformasyonu hızlı bir şekilde değişecektir. Bu da organik çözücü moleküllerinin proteinin iç kısmına erişmesine olanak sağlayacaktır. Burada bu moleküller hidrofobik etkileşimleri bozabilir ve denatürasyona sebep olabilirler.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 5. Organik Polimerler ile Çöktürme PEG(polietilen glikol) en çok kullanılan organik polimerdir. Çöktürme mekanizması organik çözücülerle çöktürme mekanizması ile benzerdir. Bununla birlikte daha düşük konsantrasyonlar gerektirmektedir, genellikle %20′den daha düşük. Daha yüksek konsantrasyonlar viskoz çözelti oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bu da çökeltinin geri kazanılmasını zorlaştırmaktadır. Polimerin molekül ağırlığı 4000′den daha büyük olmalıdır.

2. 1. Proteinleri çöktürmede kullanılan yöntemler 2. 1. 6. Denatürasyon ile Çöktürme Denatürasyon ile çöktürme eğer ilgilen protein muamele sonrasında denatüre olmuyorsa, buna karşılık kontamine edici proteinler denatüre oluyorsa, bir saflaştırma adımı olarak kullanılabilir. Denatürasyon, sıcaklığın, p. H’ın değiştirilmesi ya da organik çözücülerin eklenmesi ile gerçekleştirilebilir. Proteinlerin tersiyer yapısı denatürasyon esnasında bozulur. Bunun sonucunda rastgele sarmal yapılar oluşur. Çözelti içerisinde bu sarmallar birbirlerine dolaşırlar ve böylece agregatlar oluştururlar. Agregat oluşumu p. H ve iyonik şiddet ile geliştirilebilir. Daha çok düşük iyonik şiddette ve proteinin izoelektrik noktası civarlarında gerçekleşir.

Proteinlerin izoelektrik nokta tayini nasıl yapılır? 1) İzoelektrik Odaklama İzoelektrik odaklama, bir proteinin izoelektrik noktasını (p. I) tanımlamada kullanılan bir yöntemdir.

Düşük molekül ağırlıklı organik asitler ve bazların (amfolitler) karışımın jel boyunca elektriksel alandaki dağılımları farklı p. H değerlerini (p. H gradyanı) oluşturur. Elektriksel alandaki p. H garadientinde her protein molekülü, izoelektrik noktasına göre uygun bir yere doğru hareket eder; iki yönde etki eden kuvvetlerin eşit olduğu, p. H’ın proteinin izoelektrik noktasına eşit olduğu yerde hareketsiz kalır.

2) Minimum Çözünürlük Yöntemi Değişik p. H değerlerindeki Asetik asit/Asetat tamponlarından alınan belirli hacime eşit miktarda kazein katılır. En fazla protein çökelen çözeltinin p. H’sı kazeinin izoelektrik p. H’sıdır.

3. DENEYSEL YÖNTEM 3. 1. Deney Düzeneğinin Şematik Gösterimi ve Tanıtımı

3. 2. Deneyin Yapılışı Saf suda %20’lik süt çözeltisi hazırlanır. %2’lik HCl ile p. H 4, 6’ya düşürülür. 10 dakika boyunca karıştırılır. 1 saat çökmeye bırakılır.

3. 3. GÜVENLİK KOŞULLARI Derişik hidroklorik asit, sıvı veya katı halde organizmalar için büyük tahirbata neden olabilmektedir. Gaz halindeki bir miktar hidroklorik asitin solunumu baştan sona tüm solunum sistemini tahrip edebilmektedir. Sıvı halde de döküldüğü çoğu yüzeyi eritmektedir. Hidroklorik asit ile çalışılırken, eldiven ve koruyucu kıyafetlerin giyilmesi, hidroklorik asitten kaynaklanabilecek tahribatları düşürmekte önemlidir. Hidroklorik asidin vereceği tahribat, asidin derişimiyle alakalıdır. Biz deneyimizi yaparken %2’lik HCl kullanacağımızdan önemli bir güvenlik kaygısı bulunmamaktadır.

4. DENEY VERİLERİNİN SAPTANMASI VE ANALİZİ Sütten kazein proteini çöktürmeden önce, sütün p. H’ı, p. H metre ile ölçüldü. Bunun için, içinde balık bulunan behere %20 lik süt-su karışımı eklendi ve manyetik karıştırıcı üzerine koyuldu. p. H metrenin probu distile su ile yıkandı ve ardından beher içine koyuldu. Derişik haldeki HCl çözeltisinden damlatılmaya başlandı. Manyetik karıştırıcıda karışan süte, HCl çözeltisi eklendikçe p. H’ın düştüğü gözlendi. p. H = 4. 6 olana kadar, HCl çözeltisi ilave edildi. p. H 4. 6’da sabitlendikten sonra, manyetik karıştırıcıdan ayrışmanın olması için alındı. Bir süre beklememizin ardından kazein proteinin izoelektronik noktasında, zamanla sütten ayrılıp dibe çökmesi gerçekleşti.

5. DENEY SONUÇLARI ve YORUM Ortaya çıkan deneysel hataların kaynakları; -p. H metrenin ölçüm sırasında temiz olmaması -p. H metrenin kalibrasyonunun bozuk olması olabilir. Bu nedenle deney sırasında çözelti hazırlanırken, p. Hmetrenin kullanımı sırasında dikkat edilmeli, p. H-metrenin kalibrasyonu kontrol edilmelidir. Deney sonuçlarının tekrarlanabilirliği, deneyin tekrar aynı kişiler tarafından aynı laboratuarda aynı koşullarda gerçekleştirilmesiyle; deneyin doğruluğu ise deneyin farklı kişilerce farklı bir laboratuarda gerçekleştirilmesiyle saptanabilir.

6. KAYNAKLAR [1] T. BAYRAM , süt Serumu Proteinlerinin Peynir Altı Suyundan Elde Edilmesi, Marmara Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, İSTANBUL (2007) [2] http: //biyokure. org/protein-cokturme-yontemleri/152 [3] ‘Proteinler’ www. mustafaaltinisik. org. uk/89 -1 -07. pdf , [4] http: //tez. sdu. edu. tr/Tezler/TF 01021. pdfes [5] Proteinler, http: //www. mustafaaltinisik. org. uk/89 -1 -07. pdf , Erişim Tarihi: 02. 12. 2012 [6 ] B. ÇÖL , Biyokimya Laboratuvar Föyü, Proteinler, http: //bekircol. com/biyokimyalab/proteinler. doc, Erişim Tarihi: 02. 12. 2012