Trasferimento di materiale genetico da una cellula donatrice

Trasferimento di materiale genetico da una cellula donatrice ad una cellula ricevente Trasformazione-Coniugazione-Trasduzione Destino del DNA nella cellula ricevente: q può essere digerito q può ricombinarsi q può rimanere libero nel citoplasma q può rimanere plasmidico-episomiale. Coniugazione

TRASFORMAZIONE batteri capsulati il topo muore dal topo morto sono state isolate colonie di batteri capsulati batteri non capsulati il topo è vivo dal topo vivo sono state isolate colonie di batteri non capsulati; i fagociti controllano la proliferazione batterica batteri capsulati uccisi al calore il topo è vivo dal topo non sono state isolate colonie batteriche batteri non capsulati + batteri capsulati uccisi al calore il topo muore dal topo morto sono state isolate colonie di batteri capsulati

La trasformazione è un processo di trasferimento genetico nel quale il DNA estratto da una cellula batterica “donatrice” penetra nella cellula batterica “recettrice” integrandosi nel suo genoma. La scoperta della trasformazione risale al 1928 ad opera di Griffith, nel corso di esperimenti sullo Streptococcus pneumoniae : questo batterio quando ha la capsula resiste alla fagocitosi dei macrofagi polmonite. Griffith osservò che stipiti avirulenti non capsulati potevano essere trasformati in stipiti virulenti capsulati previa incubazione con l’estratto di uno stipite virulento capsulato ucciso al calore. Nel 1944 il “principio trasformante” scoperto da Griffith venne identificato con il DNA batterico: i batteri non capsulati sono stati trasformati hanno acquisito un nuovo carattere ereditario incorporando geni dei batteri uccisi. Le condizioni che influiscono sull’efficienza della trasformazione riguardano (1) alcune caratteristiche chimico-fisiche del DNA trasformante ed (2) un particolare stato fisiologico della cellula recettrice.

Il DNA trasformante deve essere a doppia elica, con peso molecolare > 106 d ed avere alta omologia col DNA della cellula ricevente (generalmente deve essere della stessa specie). La cellula recettrice deve trovarsi in uno stato fisiologico definito di “competenza”. Il maggior numero di cellule competenti si ha alla fine della fase di crescita esponenziale. Caratteristiche dello stato di competenza sono: • assenza di sintesi di DNA • rallentamento della sintesi della parete • presenza di sintesi proteica con produzione di particolari proteine (fattori di competenza) che alterano la permeabilità della parete.

FASI DELLA TRASFORMAZIONE 1) Assorbimento del DNA alla cellula batterica, mediante legami con recettori specifici. 2) Ingresso del DNA nella cellula. 3) Eclisse = l’attività biologica scompare per un certo tempo. Il DNA donatore, se viene estratto dalla cellula subito dopo l’ingresso, non è più trasformante (è a singola elica). 4) Ricombinazione = il DNA donatore si appaia al DNA ricevente in una zona di omologia e si sostituisce.

Proteine specifiche (fattori di competenza) si legano a recettori sulla superficie della stessa cellula e di cellule vicine (1) inducendo segnali di membrana che dereprimono geni specifici con produzione di nuove proteine, fra cui una autolisina; (2) digestione di parte della parete ed esposizione di recettori per il DNA a doppia elica (DNA-binding proteins); (3) le nucleasi digeriscono una delle due eliche di DNA; (4) introduzione del DNA a singola elica nella cellula. A questo punto si può avere ricombinazione con una zona omologa del DNA ricevente.

Per alcuni batteri (Streptococcus pneumoniae, Bacillus Subtilis, Neisseriae gonorrhaeae, Haemophilus influenzae) la trasformazione avviene spontaneamente in natura. In seguito a lisi cellulare, alcuni batteri possono rilasciare frammenti di DNA. In laboratorio si può indurre trasformazione anche in batteri che normalmente non sono trasformabili (Escherichia coli) di importanza in biotecnologia.

CONIUGAZIONE BATTERICA Coniugazione = trasferimento diretto di materiale genetico da un batterio all’altro, attraverso un pilo sessuale. La coniugazione è mediata da un plasmidi particolari, esempio il plasmide F (= Fertilità). Il plasmide F contiene diversi geni compresi i geni per il trasferimento (regione tra) che codificano (1) la produzione del pilo sessuale (2) i prodotti necessari per la replicazione e il trasferimento del DNA plasmidico con un meccanismo a rolling circle. Se batteri con il plasmide F (F+) vengono mescolati a batteri privi del plasmide F (F-), il batterio F+ attraverso il pilo di coniugazione si unisce alla cellula Fed inizia il trasferimento del DNA plasmidico.

Classificazione dei plasmidi Plasmide R

Cellule F+ pilo di coniugazione cromosoma batterico plasmide F+ F- F+ F+ L’attacco del pilo F ad un batterio F- determina l’avvio della replicazione del plasmide (meccanismo a rolling circle). Mentre la replicazione sta procedendo, l’estremo 5’ entra nel batterio F-. Finito il trasferimento, nella cellula ricevente viene sintetizzato il filamento complementare ed il plasmide si ricircolarizza. Replicazione e trasferimento del plasmide F avvengono simultaneamente. La cellula ricevente ora possiede un plasmide F completo, diventando F+, e può a sua volta trasferire il plasmide ad un'altra cellula F-.

Cellule F+ e Hfr integrazione del plasmide F nel DNA batterici Cellula F+ Cellula Hfr Le cellule Hfr mantengono la capacità di formare pili di coniugazione e possono trasferire porzioni del loro genoma ad altre cellule batteriche F-.

Coniugazione fra cellula Hfr e cellula F- Quando una cellula Hfr stabilisce un contatto con F-, il cromosoma batterico con il fattore F (cromosoma HFr) si replica e attraverso il pilo comincia a migrare nella cellula F-. L’origine del trasferimento è interna al fattore F per cui le prime sequenze a passare comprendono la testa del fattore F e le ultime la coda (vedi sequenze in verde). Quasi sempre, il pilo (estremamente fragile) si rompe prima di avere trasferito tutto il cromosoma. Quindi il fattore F, che viene trasferito completamente solo alla fine del cromosoma, non riesce a migrare per intero nella cellula ricevente F- che pertanto acquisisce nuovi caratteri genici ma non diventa Hfr o F+. Se la cellula Hfr contiene un gene cromosomico per la resistenza ad un antibiotico può trasferirlo alla cellula ricevente sensibile che diventa quindi resistente. [Il trasferimento di tutto il cromosoma batterico richiederebbe 100 min. ]

Il frammento di DNA donatore trasferito dalla cellula HFr può: essere degradato da nucleasi ricombinarsi ed integrarsi conferendo nuovi caratteri genetici cromosomici alla cellula ricevente La cellula ricevente però rimane F-, perchè non ha ricevuto l’intero fattore F.

Cellule F’ Cellula Hfr

Coniugazione nei Gram+ Le cellule F+ non formano pili sessuali, ma producono alla loro superficie una particolare sostanza che provoca l’aggregazione con i batteri F-. I plasmidi di coniugazione tramite questo aggregato batterico si trasferiscono dalle cellule F+ alle F-.

Batteriofagi Fagi virulenti Ciclo litico Testa Guaina I batteri possono essere infettati da virus specifici, i Batteriofagi o Fagi Temperati Ciclo lisogeno

Infezione litica e infezione lisogenica nei fagi temperati (a) Infezione litica (b) Infezione lisogenica

Ciclo litico: Il genoma fagico si replica utilizzando i sistemi cellulari, conseguenti: (1) profonde alterazioni metaboliche del batterio, (2) frammentazione del DNA batterico, (3) produzione di proteine fagiche, (4) assemblaggio di nuove particelle e (5) lisi cellulare e (6) liberazione di nuovi fagi infettanti. Ciclo lisogeno: Il DNA del fago si integra nel genoma batterico (PROFAGO) in corrispondenza di zone di omologia e viene attivato un repressore che reprime l’espressione di quasi tutto il genoma fagico, che rimane silente e si replica passivamente col genoma batterico. In particolari condizioni il profago può essere indotto ad “excidersi" ed originare un ciclo litico.

Trasduzione generalizzata La trasduzione è il trasferimento di materiale genetico (frammenti del genoma o plasmide) da un batterio ad un altro, mediato da un fago. Si distinguono due tipi di trasduzione: generalizzata e specializzata. Trasduzione generalizzata = qualsiasi gene batterico può essere trasferito, casualmente. Alcuni frammenti di DNA batterico possono essere impaccati per sbaglio dentro i fagi di nuova formazione purchè le loro dimensioni siano uguali a quelle del genoma fagico. Questi fagi possono infettare altri batteri, iniettando il loro DNA. Se c’è ricombinazione il batterio ricevente assume stabilmente nuovi caratteri genici. Si può avere trasduzione anche di interi plasmidi.

Trasduzione specializzata Trasferimento esclusivo di uno specifico gene batterico. Durante l’excisione del profago (segmento genomico in verde) possono verificarsi degli errori e il genoma fagico si excide insieme ad un tratto del DNA batterico adiacente (segmento genomico in rosso), fenomeno raro (circa 1 x 106 -107 cellule). Si può trasferire solo un frammento cromosomico contiguo al sito di integrazione. Se non si sono perse informazioni fagiche essenziali, il DNA fagico può replicarsi ed originare una progenie composta da particelle fagiche defettive (in cui parte del genoma fagico è stata sostituita dal DNA batterico).

CONVERSIONE LISOGENICA Nei batteri lisogeni il DNA del profago rimane silente perchè la sua espressione viene inibita da “repressori” della replicazione codificati dal genoma fagico*. In qualche caso una parte del genoma profagico non viene repressa e si ha la sintesi di prodotti virali che possono influenzare il fenotipo cellulare (produzione di tossine, espressione di nuovi antigeni, adesine, ecc. ) es. difterite = il Corynebacterium diphteriae che ospita un fago temperato (che sintetizza la tossina difterica) dà la malattia. scarlattina = lo Streptococco pyogenes che portano un fago temperato produce la tossina Eritrogenica. botulismo = il Clostridium botulinum che contiene un determinato profago produce la tossina responsabile dell’intossicazione alimentare. * Immunità fagica = i batteri che contengono fagi lisogeni non permettono la replicazione di fagi dello stesso tipo, per la presenza del repressore.

ESCHERICHIA COLI SALMONELLA RESISTENZE MULTIPLE PLASMIDE CONIUGAZIONE Una cellula di Escherichia coli che TRASPOSIZIONE BATTERIOFAGO TRASDUZIONE contiene un plasmide con il gene per la resistenza alla tetraciclina (tet) e una cellula di Salmonella con un gene per la resistenza al cloramfenicolo (cat) si coniugano e il gene tet viene trasferito alla Salmonella che diventa resistente a due antibiotici. Nella Salmonella il gene Tet presente su un trasposone si sposta sull’altra molecola di DNA plasmidico che porterà i geni per la resistenza ai due antibiotici. Infine, il plasmide con la duplice resistenza può essere di nuovo trasferito, mediante trasduzione in un’altra cellula batterica.