Qumica Biolgica Patolgica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR II

Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR II- Parte Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas 2016 Dra. Silvia Varas Tema: 1 (2) svaras@unsl. edu. ar

GENERALIDADES

Electroforesis en Gel de Agarosa üPoros de tamaño mediano. Se utiliza para separar cadenas de ADN doble cadena. Tamaño de 100 pb a 10 Kb üADN total digerido con enzimas de restricción, productos de PCR mayores de 100 pb üRNA total previo a una transferencia a membrana (Northern Blotting) üUtiliza cubas horizontales.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Agarosa 2% Xileno de cianol 0, 8 -0, 9 Kb Azul de bromofenol 0. 1 Kb

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida üPoros de tamaño pequeño. Se utiliza para separar cadenas de ADN simple cadena. Rango de separación 10 pb a 500 pb üPermite diferenciar cadenas de ADN simple cadena en 1 pb de diferencia (geles de secuenciamiento) üUtiliza cubas verticales

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Acrilamida [CH 2=CHCONH 2]n Metilen-bis-acrilamida (CH 2=CHCONH 2)2 CH 2 En presencia de Persulfato amónico y TEMED (N. N, N’ tetrametilendiamina)

Enzimas de Restricción n n Cuando una bacteria es invadida por un organismo que contiene ADN, por ej por un virus, se puede defender con las enzimas de restricción (ER), denominadas también como endonucleasas. ER reconocen una corta secuencia de ADN en forma especifica y corta ambas hebras. La secuencia de reconocimiento es un palíndrome. ER son bautizadas con el nombre de la bacteria donde se aisló, mas un número de secuencia (por ej. Eco RI).

Endonucleasa de Restricción 5’…. GAATTC. …. 3’ …. CTTAAG…. n Denominación ER: ej: Eco. RI Escherichia coli Genero Especie R 13 la 1º enzima hallada Cepa 8

5’…. GAATTC. …. 3’ …. CTTAAG…. n La Frecuencia de la presencia de la secuencia hexamérica: 1/4096 (4 -6) Al azar 9

(Fragmento mayor) (Fragmento más pequeño) Considerar una molécula de ADN linear con 6 copias de GAATTC: habrá 7 fragmentos los cuales se podrán separar por tamaño en un gel de electroforesis. Digestión del ADN con endonucleasa Eco. RI 10

Las diferentes enzimas reconocen y cortan el ADN genómico en distintas frecuencias Eco. RI reconoce la secuencia hexamérica: 4 -6 n Sau 3 A 1 reconoce la secuencia tetramérica: 4 -4 n 11

Enzimas Restricción • Sub-unidades Catalíticas • Sub-unidades Reconocimiento

Ejemplo: (Eco RI) (corta) 5’ – GAATTC – 3’ – CTTAAG – 5’ (corta)

Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas y reconocen secuencias de DNA palindrómicas Bam. HI G ' GATCC SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN Extremos cohesivos 3’ Extremos romos Extremos cohesivos 5’

Definiciones n Una probe o sonda es un secuencia de oligonucleótidos simple hebra y esta marcado con radio isótopo (32 P) o fluorescente. Su secuencia es complementaria a la secuencia de interés, cuya secuencia es conocida. n Hibridización: unión por apareamiento de bases de dos moléculas de acido nucleico. n Tm: Temperature melting= temperatura a la cual las hebras de un duplex están disociadas en un 50%.

• Calculo de Tm Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C) Ejemplo: S- IGFI: AGC CTC GAC AGC CTG CCC CAG G Tm ºC = 2( 4 + 2) + 4( 6 + 10) Tm ºC = 2(6) + 4(16) Tm ºC = 12 + 64= 76 Tm = 76 ºC

• DESNATURALIZACIÓN DEL DNA 1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza iónica

• Factores que afectan la velocidad de hibridización Longitud del acido nucleico. Composición de base. Fuerza iónica. Viscosidad. Temperatura Agentes desnaturalizantes. p. H

ØLongitud del acido nucleico. K longitud Ø Composición de base. % CG aumenta la re-asociación Ø Fuerza ionica. Na+ Ø Viscosidad aumenta la re-asociación Moléculas pequeñas (glicerol, sacarosa): disminuye la velocidad de re-asociación. Polímeros de alto PM (PVP, Dextran, Ficoll): aumenta la velocidad de reasociación.

Temperatura A Temp se rompen las uniones puentes de Hidrogeno. Se define como la t° óptima de hibridización a aquella donde la velocidad de hibridización es máxima. Y es gralmente 25ºC por debajo de la T° de melting. Agentes desnaturalizantes. Formamida: Baja la T° óptima de hibridización de 0, 72°C cada 1% p. H A una [Na. Cl] de 0, 4 M la velocidad de hibridizaciónes independiente del p. H (en un rango de 5 -9).

TIPOS de SECUENCIAS en el ADN GENOMICO 1) SC Altamente repetitiva: VNTR, STR 2) Altamente Repetitivo Medianamente repetitiva: Secuencias Alu, trasposones (LTR), RNAr, histonas, telomeros. 3) DNA copia única Genes estructura exon-intron. Medianamente Repetitivo Copia Unica DC

Genes con estructura exon-intron TGA 5’ -200 -500 -90 -75 Enhancer Caja GC Caja CAAT FT -30 TATA 5’ UTR GT AG GT 3’ 3’ UTR AG FTII + RNA pol II Transcripción +1 UGA GU 5’ UTR RNA Transcripto Primario Señal de clivaje y poliadenilación 20 -30 nt AG GU 3’ UTR AG AAUAAA Capping y Poliadenilación NUCLEO UGA CAP GU 5’ UTR AG 7 -metilguanosina RNA nuclear pequeño (sn. RNA) Spliceosoma GU Splicing UGA 5’ UTR GU GU CAP 3’ UTR AAAAA AG AG AG 3’ UTR AAAAA GU Lazo o LARIAT AG RNA mensajero MADURO CAP 5’ UTR 3’ UTR AAAAA CITOPLASMA

Polimorfismo genético n LOCUS POLIMORFICO: es una variante muy común que se encuentra en más del 1% de los cromosomas de la población en general. n MUTACION

Sin embargo, los términos "mutación" y "polimorfismo", a menudo conducen a confusión debido a suposiciones incorrectas acerca de los efectos patógenos de la “mutación” y benignos del “polimorfismo”. Se propone por lo tanto sustituir ambos términos por el término “variante” con los siguientes términos modificadores: (i) patogénica, (ii) probablemente patógena, (iii) significado incierto, (iv) probablemente benigna, o (v) benigna.

Polimorfismo genético n Tipos de POLIMORFISMOS: - SNP: Polimorfismos de nucleótido único - Polimorfismos Repetitivos: VNTR, STR, etc. - Polimorfismos de Restricción: RFLP

SNP: Polimorfismos de nucleótido único Los SNP son comunes y ocurren una vez cada 1000 pares bases. Marcarían la susceptibilidad a una enfermedad mas que su causa directa

Los Polimorfismos nucleótido único (SNPs) son secuencias en el genoma que difieren en un solo par de nucleótidos entre una porción de la población y otra. Cuando 2 alelos se comparan y hay solo 1 nt de diferencia se llama SNP, (pronunciado como snips) (single nucleotide polymorphisms). Hay mas de 10 millones de SNP Se han identificado mas de 6 millones de SNP Hay 1 SNP/1000 pb.

Polimorfismos Repetitivos üVNTR (Variable number of tandem repeat), Ej: [CTGATCTATAGTAC]n üSTR, (Short tandem repeat), Ej: [ CG ] n üDonde n= 20, 50 ó 70 veces

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) üComo se puede detectar un RFLP? a) Por técnicas de Southern Blotting 1. Extracción de ADN 2. Digestion con la Enzima de Restricción apropiada 3. Separación de los fragmentos por electroforesis y transferencia a membrana (Southern Blotting) 4. Hibridización con la Sonda o Probe especifica, revelado. 5. Análisis de los resultados

RFLPs Condición: n La presencia de una mutación es ligada a un polimorfismo de restricción n La mutación y el polimorfismo no deben estar separados a una distancia mayor de 106 nucleótidos para que sean coheredados juntos. n

C B A

n PCR: PRINCIPIOS PCR es un sistema no celular de clonado del ADN

Kary Mullis, el inventor de la PCR fue premiado en 1993 con el Premio Nobel en Química

El ciclo de amplificación de PCR Cada ciclo requiere tres pasos de temperaturas para completar un ronda de la síntesis de ADN.

El perfil de temperatura de un ciclo de PCR es controlado por el programa del termociclador. n Hay un incremento exponencial del producto de PCR hasta cerca del ciclo nº 30. n

Ventajas y Desventajas VENTAJAS: Rapidez Sensibilidad Fortaleza n DESVENTAJA DE PCR COMO METODO DE CLONADO: Se debe conocer la secuencia Producto generalmente pequeño Infidelidad de la replicación del ADN n

Nomenclatura Hebras de ADN ! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5’ 3’ 3’ 5’ Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

Paso 1: Desnaturalización del DNA Esto ocurre a 92 -95 ºC

Paso 2: Annealing o Unión de Primers Reverse Primer Forward Primer Los cebadores se unen a la secuencia complementaria sobre DNA target.

Paso 3: Extensión o “Primer Extension” 5’ 3’ extension 3’ 5’ DNA polimerasa cataliza la extensión de la hebra en sentido 5’ 3

n El nuevo ciclo se inicia por desnaturalización de las nuevas hebras formados en el ciclo previo.

Amplificación Exponencial Ciclos Copias 1 2 2 4 4 16 10 1. 024 15 32. 768 20 1. 048. 576 25 33. 554. 432 30 1. 073. 741. 824

Fases en una reacción de PCR n n n El producto de PCR se acumula en función del número de ciclos. Se distinguen las siguientes fases: La fase exponencial hasta cerca del ciclo 30 esta bajo las condiciones estándar de reacción. La fase plateau resulta de cantidades limitantes de enzima y/o reducción actividad enzimática.

Causas del Efecto Plateau n Agotamiento de los sustratos (d. NTPs o primers). n Estabilidad de los reactivos (d. NTPs o enzima) particularmente a la tº de desnaturalización. n Inhibición por los productos finales generados (pirofosfato, duplex de DNA).

n Hasta acá llegue el lunes…

El tamaño del fragmento producido en PCR depende de los primers Reverse primer Forward primer Tamaño de los fragmentos que son amplificados

Seminarios:

Elementos de una PCR especifica 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Calidad Templado Concentración Enzima Secuencia Iniciadores Concentración, pureza y estabilidad Temperatura de anneling Concentración de Magnesio Concentración de Nucleótidos Condiciones del medio: Buffer, p. H, etc. Aditivos: Formamida, DMSO, glicerol, etc.

Temperatura de anneling n Temperatura de Annealing: ~ 5 o. C menos que la Tm de los primers Tm = 4(G + C) + 2(A + T)o. C (o usar el Tm provisto por planilla del proveedor) en la tº anneling resulta en una union noespecífica. en la tº annealing resulta en reducción en el rendimiento

G: · 3 ; A: 11 C: 5 T: 7 ; TOTAL= 26 nt Tm= 4. 8+2. 18=32+36=68ºC

Típica reacción de PCR: 1. El

Tipos de PCR-RFLP ARMS-PCR MAS-PCR PCR- SONDAS ASO (DOT BLOT) GAP-PCR MUTAGENESIS MEDIADA POR PCR

Elementos de Laboratorio

TUBOS EPPENDORF 200 l 500 l 1, 5 ml

Pipetas Automáticas P-1000 100 -1000 l P-200 20 -200 l P-100 10 -100 l P-10 0, 5 -10 l

Termocicladores