Cianobaktriumok izollsa s megszmllsa Ksztette Horvth Attila Cianobaktriumok
Cianobaktériumok izolálása és megszámlálása Készítette: Horváth Attila
Cianobaktériumok • Prokarióta mikroorganizmusok • Fotoszintetizálnak, így O 2 -t termelnek • Megjelenési formáik – Egysejtűként – Telepes szerkezetben – Fonalas formában • Átlagos sejtméretük 1 -6 μm • Nitrogén megkötésre képesek -> talaj revitalizációra is szokták alkalmazni
Tálcák előkészítése A cianobaktériumokat szaporítás után konzerválni kell, nem szabad hűtőben tartani, más prokariótákkal ellentétben • A következő dián látható 2 közegből egyet kiválasztunk • Ezt 121 °C-on 20 percig sterilizáljuk, használat előtt 48 °C-os vízfürdő • 4 hígítási tartomány kijelölése, ahol optimális a baktérium számlálás • 1 ml kevert szuszpenziót kimérünk egy steril Petri-csészére 1 ml-es steril pipettával, a leghígabb oldattal kell kezdeni • Öntsünk 15 ml tápoldatot a Petri-csészére, óvatosan össze kell keverni • Ha a tápközeg megszilárdult, fordítsuk meg és tegyük inkubátorba
Alkalmazható tápközegek 1. • Tápoldat A (Allen 1968) • • • 1. 500 g Na. NO 3 0, 039 g K 2 HPO 4 0, 075 g Mg. SO 4*7 H 20 0, 020 g Na 2 CO 3 0, 027 g Ca. Cl 2 0, 058 g Na 2 Si. O 2*9 H 2 O 0, 001 g EDTA 0, 006 g citromsav 0, 006 g Vas-citrát 1000, 000 ml desztillált víz 1, 000 ml mikroelem oldat A p. H-t 7, 8 -ra kell beállítani 1 ml mikroelem oldat tartalmazza: • • 2, 8600 g H 3 BO 4 1, 8100 g Mn. Cl 2*7 H 2 O 0, 2220 g Zn. SO 4*7 H 2 O 0, 3910 g Na 2 Mo. O 4*2 H 2 O 0, 0790 g Cu. SO 4*5 H 2 O 0, 0494 g Co(NO 3)2*6 H 2 O 1000, 000 ml desztillált víz • A szilárd táptalaj előállításához 1, 5 % autoklávban csírátlanított agart (48 °C) adunk az oldathoz.
Alkalmazható tápközegek 2. • Tápoldat B (Castenholz 1970) • • • 0, 100 g nitrilo-triecetsav 0, 060 g Ca. SO 4*2 H 20 0, 100 g Mg SO 4*7 H 2 O 0, 008 g Na. Cl 0, 103 g KNO 3 0, 689 Na. NO 3 0, 111 g Na. HPO 4 1, 000 ml Fe. Cl 3 oldat (0, 2905 g/l) 0, 500 ml mikroelem oldat 1000, 000 desztillált víz A p. H-t 8, 2 -re állítjuk Na. OH, ami az autokláv után 7, -7, 6 -ra áll be 1 ml mikroelem oldat tartalmazza: • • 2, 280 g Mn. SO 4*H 2 O 0, 500 g Zn. SO 4*7 H 2 O 0, 500 g H 3 BO 4 0, 025 g Na 2 Mo. O 4*2 H 2 O 0, 025 g Cu. SO 4*5 H 2 O 0, 045 g Co. Cl 2*6 H 2 O 0, 500 ml H 2 SO 4 1000, 000 kétszer desztillált víz A szilárd táptalaj előállításához 1, 5 % autoklávban csírátlanított agart (48 °C) adunk az oldathoz.
Szilárdított agart tartalmazó Petricsésze • A tápközeg sterilizálása autoklávban 120 °C-on 20 percig zajlik, majd lehűtés 48 °C-ra • 15 ml tápoldatot öntsünk minden Petri-csészére és hagyjuk megszilárdulni az agart • A csészéket 2 napig pihentetjük szobahőmérsékleten viszonylag védett helyen vagy inkubátorban • A nem azonnal felhasznált csészéket hűtőben tárolhatjuk • 4 hígítási tartományt jelölünk ki a megfelelő sejtszám meghatározásért • 0, 1 ml-es alikvot mintákat mérünk ki 3 párhuzamos mérésre minden hígításból, kezdve a leghígabbal • Steril üveg szélesztőbottal terítsük szét a szuszpenziót • Fordítsuk le a csészét és tegyük inkubátorba
Cianobaktériumok számlálása • Legvalószínűbb élősejtszám módszer (Most probable Number Method- MPN) • • • Mikroorganizmusok jelenlétét vagy hiányát vizsgálja a talajok vagy más anyagok egymást követő hígításainak különböző egyedi részeiben Oldatok Megfelelő szubsztrátnak az alábbi tápanyag oldatok egyikét vagy egy másik standard tápanyag oldatot használjunk Bristol oldat (A) -1, 0 g Na. NO 3 -1, 0 g K 2 HPO 4 -0, 3 g Mg. SO 4 7 H 2 O -0, 1 g Na. Cl -Nyomnyi Fe. Cl 3*6 H 2 O Wilson oldat (B) -1, 00 g Ca(NO 3)2 -0, 25 g K 2 HPO 4 -0, 25 g Mg. SO 4 7 H 2 O -0, 25 g KCl -0, 30 g Fe. Cl 3*6 H 2 O 800 ml desztillált vízben feoldva és 1000 ml-re feltöltve
• (A) Bristol-oldat – – 8 unciás csavaros tetejű palack 36 gömbölyű üveggyönggyel A gyöngyök a talaj aggregátumokat szedik szét 95 ml víz • (B) Wilson-oldat – 8 unciás csavaros tetejű palack – 90 ml víz – Üveggyöngyök nélkül Egy talajmintához szükséges 1 vakminta gyöngyökkel és 7 anélkül
Számlálás előkészítése • Minden talajmintához készítsünk 1 vak hígítást 95 ml vízzel és 15 -20 gyönggyel, illetve 7 -et gyöngyök nélkül, 90 ml vízzel • Zárjuk rá kupakokat, és tegyük 121 °C-os autoklávba, 20 percre, majd hűtsük le szobahőmérsékletre • Tegyünk 10 g talajt a 95 ml vizet tartalmazó üres hígításos palackba. • 10 percig keverjük vízszintesen a dugattyús keverőben, majd kézzel is rázzuk össze • Azonnal mérjünk ki pipettával 10 ml-t a 90 ml-es üres hígításos palackba. -> ez lesz a 10 -2 hígítási tag • Folytassuk a hígítást addig, amíg megfelelő tartományt el nem értünk (10 -7 -10 -9 hígítás) • Minden sikeres hígításból 1 ml-t bemérünk a inkubációs-csónakba • 4 hétig 22 °C-on inkubáljuk szórt napfény, izzó vagy fluoreszcens fény mellett
• A beoltott konténerekben hetente egyszer vizsgáljuk meg a cianobaktérium szaporodását, ami felismerhető felszíni gyűrűk vagy hártyák alapján • Mikroszkópban közvetlen vizsgálatot folytathatunk • Rögzítsük az egyes hígításokban előforduló baktériumok számát • Ebből meghatározható a legvalószínűbb élősejtszám (MPN)
- Slides: 10